摘要
體外轉(zhuǎn)錄 (in vitro transcribed, IVT) mRNA技術(shù)發(fā)展迅速, COVID-19大流行中mRNA疫苗的廣泛應(yīng)用引起了公眾對mRNA技術(shù)的討論。相比傳統(tǒng)蛋白藥物, IVT mRNA有成本低、模塊化生產(chǎn)以及序列易調(diào)整等優(yōu)勢, 具有廣泛的應(yīng)用前景; 但由于mRNA藥物的歷史較短, 其缺乏足夠的臨床數(shù)據(jù), 且除mRNA疫苗以外的mRNA藥物沒有質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。本文討論了IVT mRNA藥物的序列設(shè)計、遞送載體、給藥方式、應(yīng)用前景及安全性, 并對其質(zhì)量控制進(jìn)行簡單探討。
正文
IVT mRNA技術(shù)
RNA序列可以通過多種方法獲取, 其中體外轉(zhuǎn)錄(in vitro transcribed, IVT) 技術(shù)在mRNA藥物中應(yīng)用最廣。20世紀(jì)90年代起, 人們就開始了對IVT mRNA藥物的探索。IVT mRNA是指以DNA為模板, 由RNA聚合酶在無細(xì)胞體系下催化轉(zhuǎn)錄出的mRNA。
mRNA藥物具有轉(zhuǎn)錄時不依賴細(xì)胞、序列易調(diào)整、理論上無整合風(fēng)險、低成本、高效且可模塊化生產(chǎn)等優(yōu)點，但目前仍存在組分具有免疫刺激性、研究成果主要來源于嚙齒類等小型動物等挑戰(zhàn)。本節(jié)將簡述IVT mRNA技術(shù), 包括其序列設(shè)計、載體選擇及給藥方式。
mRNA序列設(shè)計
.mRNA序列包括5個部分: 5′帽子、5′和3′非編碼區(qū)(UTR)、開放閱讀框和多聚腺苷酸 (poly(A)) 尾; 自復(fù)制型mRNA還包含正鏈RNA病毒的復(fù)制酶序列。IVT mRNA 以線性化的 DNA 質(zhì)粒或鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)的DNA產(chǎn)物為模板, 由噬菌體RNA聚合酶在體外催化轉(zhuǎn)錄獲取, 加帽和加尾可以在轉(zhuǎn)錄同時或轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行; 所得的產(chǎn)物需進(jìn)行純化。本小節(jié)將依次介紹IVT mRNA 5′帽子、poly(A)尾、UTR、編碼區(qū)的設(shè)計思路, 以及全序列的核苷酸修飾、序列優(yōu)化和產(chǎn)物純化思路。
5′帽子及加帽方法
正確的5′帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppN)參與阻止mRNA被核酸外切酶降解、降低 mRNA 免疫原性, 調(diào)節(jié)mRNA半衰期以及調(diào)控翻譯等過程。5′帽子結(jié)構(gòu)按mRNA 5′末端兩個核苷酸甲基化數(shù)量分為0型、1型和2型。真核細(xì)胞mRNA具有1型或2型帽子, 而現(xiàn)有技術(shù)可以給IVT mRNA加0型或1型帽子。
加帽方法分為兩種: 第一種是酶法加帽, 即在轉(zhuǎn)錄完成后使用加帽酶進(jìn)行加帽;第二種是共轉(zhuǎn)錄加帽, 即在轉(zhuǎn)錄體系內(nèi)加入帽類似物以實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄同時加帽。mRNA體外轉(zhuǎn)錄加帽時, 存在未加帽或不完全加帽產(chǎn)物, 用特定的酶降解錯誤加帽的mRNA可以提高產(chǎn)物均一性, 例如, 用脫帽酶DXO/Dom3Z可以脫帽并降解不完全加帽產(chǎn)物。
poly(A) 尾及加尾方法
mRNA的poly(A)尾具備調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性和調(diào)控翻譯的作用。IVT mRNA加尾方法有兩種。第一種是在DNA模板中設(shè)計poly(A)尾結(jié)構(gòu), 實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄時加尾。轉(zhuǎn)錄時加尾的優(yōu)勢在于盡量保證每條產(chǎn)物的poly(A)尾長度相同; 然而, 較長的poly(A)結(jié)構(gòu)會影響質(zhì)粒穩(wěn)定性, 導(dǎo)致質(zhì)粒復(fù)制時易發(fā)生缺失, 針對這一問題, 可以采用在poly(A)尾序列中插入一段10 bp連接子的方法進(jìn)行規(guī)避。第二種方法是轉(zhuǎn)錄后加尾, 在轉(zhuǎn)錄后由poly(A)聚合酶催化合成poly(A)尾, 這種方法的優(yōu)勢是可摻入修飾的核苷酸。
5′和3′UTR設(shè)計
5′和3′UTR參與調(diào)控翻譯、增強mRNA穩(wěn)定性、輔助蛋白產(chǎn)物定位等。選擇高表達(dá)基因的UTR可以提高mRNA表達(dá)效率, 但UTR的效率因細(xì)胞而異, 需對其進(jìn)行針對性的優(yōu)化。UTR 的一個優(yōu)化方向是通過選擇含有特定序列的UTR、減少小干擾RNA結(jié)合位點、減少3′UTR的AU含量以及設(shè)計特殊的UTR結(jié)構(gòu)等方法增強mRNA 穩(wěn)定性;另一個優(yōu)化方向是調(diào)整UTR序列, 改變其招募核糖體或其他調(diào)控蛋白的能力, 從而調(diào)整mRNA在細(xì)胞內(nèi)的翻譯效率。考慮到改變3′UTR有可能影響產(chǎn)物定位, 實施上述UTR優(yōu)化后應(yīng)對產(chǎn)物的定位情況進(jìn)行檢測。
編碼區(qū)設(shè)計
編碼區(qū)的設(shè)計涉及密碼子優(yōu)化的共有需求, 以及信號肽選擇、設(shè)計多順反子結(jié)構(gòu)、插入復(fù)制酶序列等具體需求。
同義密碼子的選擇影響蛋白質(zhì)的翻譯速率, 由于不同物種細(xì)胞對同義密碼子有不同的偏好, 在利用mRNA表達(dá)異種蛋白時, 需要對密碼子進(jìn)行優(yōu)化。加速翻譯的密碼子選擇思路有: 使用最優(yōu)密碼子、參考密碼子的天然占比或根據(jù)tRNA豐度選擇密碼子等。然而, 適當(dāng)含量的稀有密碼子對延遲翻譯速率,確保蛋白質(zhì)正確折疊是必需的, 因此不能一味加速翻譯。
密碼子優(yōu)化已應(yīng)用于IVT mRNA藥物。Mauro等討論了體內(nèi)用藥的密碼子優(yōu)化的安全性: 同義密碼子替換時, 存在改變mRNA高級結(jié)構(gòu)從而影響其他反式元件的結(jié)合、改變翻譯速率從而影響翻譯后修飾, 以及改變內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點從而導(dǎo)致新肽產(chǎn)生或隱肽丟失等風(fēng)險。在對IVT mRNA進(jìn)行密碼子優(yōu)化時,應(yīng)充分考慮上述問題并進(jìn)行足量試驗。
密碼子優(yōu)化是編碼區(qū)設(shè)計時必須要考慮的, 此外,不同蛋白產(chǎn)物可能有精確定位、同時翻譯多條肽鏈、長效表達(dá)等特殊需求, 這些需求都可以通過設(shè)計特殊的編碼區(qū)序列來實現(xiàn)。
蛋白產(chǎn)物常有定位至細(xì)胞特定區(qū)域或分泌的需求, 這種定位需要信號肽引導(dǎo), 然而, 同一段信號肽在不同細(xì)胞內(nèi)強度可能不同。Fattori等在質(zhì)粒介導(dǎo)肌肉細(xì)胞表達(dá)促紅細(xì)胞生成素的動物模型中, 將促紅細(xì)胞生成素的信號肽替換為組織型纖溶酶原激活劑的信號肽, 觀察到促紅細(xì)胞生成素分泌量增加。將編碼區(qū)內(nèi)原有的信號肽替換為靶細(xì)胞中天然的信號肽類型, 可能獲得更高的蛋白分泌量。
將多條肽鏈組成的蛋白設(shè)計成IVT mRNA藥物, 或是設(shè)計多聯(lián)mRNA疫苗時, 需要實現(xiàn)多條肽鏈的同時翻譯。目前有兩種方法可以滿足上述需求: 一是設(shè)計多順反子mRNA來串聯(lián)多個編碼區(qū), 但在實際研究中發(fā)現(xiàn)此種方法存在核糖體移碼以及內(nèi)部起始的風(fēng)險; 二是同時遞送多條mRNA, 此時要考慮mRNA之間的摩爾比, 例如, Wu等設(shè)計的抗PD-1/PD-L1雙特異性抗體的LNP-mRNA, 輕鏈和重鏈mRNA摩爾比為0.6∶1, 因為短mRNA翻譯更快。
自復(fù)制型mRNA的編碼區(qū)內(nèi)插入了病毒復(fù)制酶的序列, 可以實現(xiàn)mRNA的長效表達(dá), 用藥劑量更低, 且表達(dá)抗原類蛋白時自身具有佐劑作用。自復(fù)制型mRNA的上述優(yōu)點可以降低總生產(chǎn)成本; 其缺點是復(fù)制酶序列一般較長且可能包含剪切位點, 易導(dǎo)致mRNA穩(wěn)定性下降, 且過度激活的一型干擾素反應(yīng)會導(dǎo)致炎癥、自復(fù)制型mRNA表達(dá)量下降以及T細(xì)胞耗竭。
IVT mRNA的核苷酸修飾或序列優(yōu)化
天然mRNA含有一定比例的核苷酸修飾。未修飾的mRNA可被模式識別受體識別, 例如mRNA的高G、U區(qū)域可被 TLR7和TLR8識別并誘發(fā)一型干擾素反應(yīng)。因此, IVT mRNA 結(jié)構(gòu)基本設(shè)計完成后, 還需要進(jìn)行核苷酸修飾或是序列優(yōu)化設(shè)計, 結(jié)合產(chǎn)物純化來進(jìn)一步降低免疫原性, 提升表達(dá)效率。
在 mRNA 體外轉(zhuǎn)錄時摻入修飾的核苷, 如假尿苷、N1-甲基假尿苷等, 可以降低其免疫原性、增強穩(wěn)定性并提高產(chǎn)出。IVT mRNA 的核苷修飾已有廣泛研究, 核苷修飾的新冠 mRNA疫苗已得到緊急使用授權(quán)。核苷修飾的爭議在于人工修飾的mRNA的核酸修飾比例遠(yuǎn)高于天然mRNA, 且修飾有時并不能提高產(chǎn)出, 甚至可能存在損害內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點等風(fēng)險。
此外, 核苷酸修飾不適用于自復(fù)制型mRNA, 因為體內(nèi)合成的新鏈無法復(fù)制母鏈的修飾形式。Yu等總結(jié)道, 有些修飾會增加mRNA的免疫原性, 因此應(yīng)選擇天然的修飾形式。修飾的核苷酸關(guān)系到其他元件與 mRNA的結(jié)合, 從而影響mRNA的翻譯, 在對IVT mRNA進(jìn)行修飾時應(yīng)將這一點納入考慮。
mRNA序列優(yōu)化可以代替核苷修飾。減少尿苷是序列優(yōu)化的一種思路, 例如Vaidyanathan等設(shè)計的減少尿苷含量的Cas9 mRNA在細(xì)胞系和人原代CD34+細(xì)胞中活性提高。序列優(yōu)化與核苷修飾也可結(jié)合使用。使用高效液相色譜等純化方法去除流產(chǎn)性轉(zhuǎn)錄本及雙鏈 RNA 等副產(chǎn)物, 可降低 mRNA 產(chǎn)物免疫原性,提高產(chǎn)出。
無論是核苷修飾還是序列優(yōu)化, 理論上均存在改變mRNA高級結(jié)構(gòu), 改變翻譯后修飾, 改變內(nèi)部起始位點等風(fēng)險, 應(yīng)用時需充分考慮風(fēng)險因素, 進(jìn)行足量試驗。
mRNA遞送載體與給藥方式
mRNA藥物需要遞送至生物體內(nèi)以發(fā)揮作用。目前有兩種mRNA遞送思路, 一種是直接將裸露的或載體包裝的mRNA直接遞送到生物體內(nèi); 另一種是采用過繼細(xì)胞療法, 將mRNA遞送到離體細(xì)胞, 再回輸進(jìn)生物體。
正確的翻譯后修飾依賴于精確遞送, 因為同一mRNA在不同細(xì)胞中翻譯效率可能不同, 從而導(dǎo)致折疊異常; 后續(xù)的糖基化修飾與蛋白剪切也可能不同。選擇適當(dāng)?shù)倪f送載體和給藥方式, 可以使 mRNA較精確地遞送至靶器官乃至靶細(xì)胞, 下文將介紹常用的mRNA遞送載體及其給藥方式。
mRNA 離體遞送后細(xì)胞回輸
mRNA遞送至離體樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)的方式多樣, 包括電穿孔法、顯微注射法及基因槍等。目前已有多項研究將腫瘤抗原或HIV抗原mRNA遞送至患者DC, 制成治療性疫苗后回輸。mRNA過繼療法的優(yōu)點是可精確定位至某種細(xì)胞，缺點是成本高、后續(xù)操作復(fù)雜且可選細(xì)胞種類受限。
mRNA 體內(nèi)直接遞送的載體
直接遞送裸的或結(jié)合載體的mRNA至體內(nèi), 相比離體遞送操作更簡便。選擇適當(dāng)?shù)妮d體和給藥途徑, 可使mRNA靶向遞送至部分器官, 但目前未完全實現(xiàn)細(xì)胞層面的 mRNA 靶向遞送。
RNA藥物的載體可分為非包裝載體和包裝載體。非包裝類載體包括肽類、無機納米顆粒和聚合物納米顆粒等; 包裝類載體有各類脂質(zhì)體、外泌體和病毒樣顆粒等。
裸mRNA
裸mRNA分子量大且?guī)ж?fù)電, 較難通過帶負(fù)電的細(xì)胞膜。直接注射的裸mRNA在體內(nèi)的半衰期約為8～10 h。裸RNA可以被清道夫受體介導(dǎo)內(nèi)吞, 經(jīng)內(nèi)體逃逸過程進(jìn)入細(xì)胞, 但效率低下; 未成熟DC細(xì)胞可以通過巨胞飲機制大量攝取 mRNA。總體而言, 裸 mRNA 有細(xì)胞攝取效率低、具有免疫刺激性以及易被降解等問題, 因此mRNA的遞送一般需要配合載體。
多肽
富含帶正電或兩親性氨基酸的肽類可做mRNA遞送載體。魚精蛋白富含 L-精氨酸, 是一種帶正電的天然蛋白, 可結(jié)合RNA, 增強其穩(wěn)定性并以內(nèi)體途徑遞送RNA。將魚精蛋白、陽離子脂質(zhì)及mRNA制成混合顆粒可以提高遞送效率。魚精蛋白-RNA可以激活Toll樣受體TLR7/8, 因此魚精蛋白-mRNA可作為其自身佐劑。細(xì)胞穿透肽是一類可攜帶大分子進(jìn)入細(xì)胞的短肽, 其主要作用機制包括細(xì)胞膜瞬時打孔和內(nèi)吞, 機制選擇依賴于細(xì)胞穿透肽和mRNA的濃度。細(xì)胞穿透肽PepFect14成功將卵巢癌治療性mRNA遞送至異種移植小鼠模型的卵巢癌細(xì)胞。肽類載體口服利用度低, 需通過注射或鼻吸入給藥。
無機納米顆粒
無機納米顆粒作為核酸類藥物遞送載體的優(yōu)點是尺寸小、易修飾, 且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。常用的無機納米顆粒載體包括金納米顆粒和碳納米顆粒等, 其免疫原性較弱。細(xì)胞可通過A類清道夫受體介導(dǎo)的內(nèi)吞攝取多價核酸金納米顆粒, 顆粒經(jīng)內(nèi)體逃逸途徑釋放至胞質(zhì)。
聚合物納米顆粒
聚合物納米顆粒是由陽離子或可電離多聚物形成的復(fù)合體, 結(jié)合mRNA后通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞。聚乙烯酰胺(PEI)是最常用的mRNA陽離子聚合物遞送載體, 但其電荷密度高, 高濃度PEI會導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷與細(xì)胞凋亡; 此外, PEI-mRNA在儲存中易聚集并失活。pH響應(yīng)的聚合物納米顆粒對細(xì)胞損傷較小, 例如, 電荷可變的可釋放轉(zhuǎn)運體僅在細(xì)胞質(zhì)pH下降解并釋放出mRNA。
納米乳
納米乳是納米尺寸的液滴分散在另一種不混溶液體介質(zhì)形成的膠體。陽離子納米乳由陽離子脂質(zhì)DOTAP或其類似物與其他組分共同構(gòu)成, mRNA吸附在陽離子脂滴表面。MF59是一種水包油納米乳佐劑, Brito等以加入DOTAP的MF59作為載體, 通過肌肉注射給藥成功向多種動物遞送了多種病毒抗原的自復(fù)制型mRNA。陽離子納米乳載體在黏膜給藥方面有較好的應(yīng)用前景。
相比裸遞送和非包裝載體遞送, 包裝類載體遞送是更常用的遞送方式。
脂質(zhì)納米顆粒
納米脂質(zhì)體(lipid nanoparticles, LNP)是目前應(yīng)用最廣泛的IVT mRNA載體。在用于mRNA遞送之前, 已有多種LNP載體的抗生素藥物和一種siRNA藥物在歐美批準(zhǔn)上市, 因此LNP是一種研究相對成熟的藥物遞送載體。LNP是由可電離脂質(zhì)(或陽離子脂質(zhì))、膽固醇、輔助脂質(zhì)以及聚乙二醇修飾的脂質(zhì)組成的雙層結(jié)構(gòu), 其中可電離脂質(zhì)在內(nèi)層結(jié)合mRNA, 外層是脂質(zhì)外殼。
傳統(tǒng)LNP靶向肝臟, 但對LNP進(jìn)行修飾可以改變其靶向性并提高穩(wěn)定性。向傳統(tǒng)LNP添加不同電性的選擇性器官靶向脂質(zhì)可以改變LNP器官靶向性, 中性靶向肝、陽離子靶向肺、陰離子靶向脾。向LNP摻入帶有不同頭部基團或尾部結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)或用模擬細(xì)胞表面特異性受體的配體的化合物修飾LNP可提高LNP的細(xì)胞靶向性。
盡管LNP是相對成熟的mRNA遞送載體, 其生產(chǎn)門檻和高昂的儲存運輸成本仍是產(chǎn)品推廣的障礙: 全球范圍內(nèi)有能力生產(chǎn)LNP的企業(yè)很少; 部分基于LNP技術(shù)的新冠mRNA疫苗對冷鏈的要求較高。目前有熱穩(wěn)定性較好的LNP-mRNA新冠疫苗在研, 這一成果為提高LNP-mRNA類藥物的可及性做出了貢獻(xiàn)。
脂質(zhì)復(fù)合物
脂質(zhì)體復(fù)合物(lipopolyplex, LPP)是另一類研究較多的IVT mRNA遞送載體, 其由陽離子多聚物和多種脂質(zhì)組成, 陽離子多聚物在內(nèi)層結(jié)合mRNA, 外層是脂質(zhì)外殼。LPP相對LNP有更好的穩(wěn)定性: Ewe等制備的 PEI 與脂質(zhì) DPPC 組成的LPP在37 ℃下儲存14天仍可保持60%的轉(zhuǎn)染活性; Yang等設(shè)計的新冠病毒全長 S 蛋白LPP疫苗SW0123在4 ℃下儲存4～6周, 對其在小鼠中的免疫原性無影響。
LPP的另一特點是靶向性不同于LNP: 小鼠肌肉注射的LNP很快遷移至肝臟, 而LPP主要停留在注射局部。小鼠靜脈注射的LPP主要靶向肝臟及淋巴結(jié), 被樹突狀細(xì)胞經(jīng)大胞飲攝取。
外泌體
外泌體是內(nèi)體來源的納米級細(xì)胞外囊泡, 廣泛存在于生物體, 在細(xì)胞間運送RNA、蛋白及脂質(zhì)等, 傳遞信號。由于外泌體是內(nèi)源囊泡, 相對其他載體, 具有穩(wěn)定性高、毒性較低及可穿越多種生物屏障等優(yōu)勢。Tsai等從HEK293細(xì)胞獲取外泌體, 搭載新冠抗原后, 免疫小鼠, 刺激了特異性免疫應(yīng)答。肌肉注射或眼部給藥的外泌體-mRNA主要在注射局部表達(dá), 也有少量擴散至全身。動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠模型接受注射搭載改造的IL-10 mRNA的外泌體, 外泌體定位至主動脈斑塊并表達(dá)IL-10。
病毒樣顆粒
病毒樣顆粒(VLP)是自組裝的均質(zhì)納米顆粒, 來源于病毒外殼的衣殼蛋白, 可用于多種生物分子的遞送。噬菌體來源的MS2 VLP適合核酸類的遞送。Prel等使用MS2嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒在體內(nèi)和體外遞送了多種 mRNA。VLP作為載體的優(yōu)點是可修飾, 缺點是易被吞噬細(xì)胞介導(dǎo)清除以及自身不穩(wěn)定等。
mRNA 體內(nèi)給藥方式
mRNA的體內(nèi)給藥方式多樣, 包括注射(靜脈、皮內(nèi)、皮下、肌肉、淋巴結(jié)等)和吸入等, 其選擇取決于所選載體和藥物類型。RNA疫苗通常以皮內(nèi)、皮下、淋巴結(jié)或肌肉注射方式給藥。mRNA 用于表達(dá)非抗原的蛋白時, 靜脈注射是較為常見的給藥方式。靶向特定器官的mRNA可使用特殊給藥方式實現(xiàn)局部遞送, 例如呼吸道疾病 mRNA疫苗或肺部疾病治療性mRNA 可通過霧化吸入方式直接遞送至肺部, 減少mRNA的全身暴露。
總體而言, 目前關(guān)于mRNA載體和給藥方式的研究較為多樣, 但主流研究方向仍是 LNP載體配合注射給藥, 其余方向研究有限。此外, mRNA的細(xì)胞靶向性遞送的問題也尚未完全解決。加強其他載體的研究、優(yōu)化載體以提升靶向性等都是將來可以拓展研究的方向。
mRNA療法應(yīng)用前景
mRNA的應(yīng)用前景廣泛, 理論上可應(yīng)用于疾病預(yù)防、癌癥疫苗、HIV治療性疫苗、脫敏療法、蛋白質(zhì)替代療法、基因編輯和再生醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域。在此對mRNA藥物的上述應(yīng)用領(lǐng)域, 以及相比傳統(tǒng)藥物的優(yōu)缺點進(jìn)行簡要介紹。
mRNA腫瘤疫苗
腫瘤疫苗是mRNA療法中歷史較長、較成熟的應(yīng)用, 目前有大量臨床前和臨床成果。mRNA腫瘤疫苗的研發(fā)思路包括用編碼腫瘤抗原的mRNA轉(zhuǎn)染離體樹突狀細(xì)胞(DC)并回輸、直接注射裸露的或有載體包載的腫瘤抗原mRNA以及用編碼嵌合抗原受體的mRNA轉(zhuǎn)染離體T細(xì)胞并回輸?shù)? 也可選擇免疫調(diào)節(jié)分子等作為靶點。mRNA-細(xì)胞療法的成本高、操作復(fù)雜, 且相比傳統(tǒng)細(xì)胞療法優(yōu)勢不明顯，而體內(nèi)直接遞送腫瘤抗原mRNA更能發(fā)揮mRNA藥物低成本的優(yōu)勢, 有更好的應(yīng)用前景。
mRNA HIV治療性疫苗
HIV治療性mRNA疫苗有兩種技術(shù)路線, 一是用載體直接向體內(nèi)遞送編碼HIV抗原的mRNA, 二是用編碼HIV抗原的mRNA轉(zhuǎn)染離體DC并回輸。
目前轉(zhuǎn)染DC回輸?shù)囊呙缪邪l(fā)路線進(jìn)展較快, 已進(jìn)入臨床試驗階段。HIV治療性mRNA疫苗與雞尾酒療法(HAART)或抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(ART)聯(lián)用的Ⅰ期及Ⅱ期臨床試驗, 成功在患者體內(nèi)誘導(dǎo)了HIV特異性免疫反應(yīng)。
mRNA藥物用于感染性疾病主動免疫
相比傳統(tǒng)的感染性疾病預(yù)防疫苗, mRNA疫苗具備以無細(xì)胞形式生產(chǎn)、生產(chǎn)效率高、成本低、可修改序列以應(yīng)對病原體變種等優(yōu)勢, 且理論上無整合風(fēng)險。在COVID-19大流行期間, mRNA預(yù)防疫苗發(fā)揮了重要作用。mRNA疫苗的大規(guī)模臨床試驗也推動了mRNA疫苗技術(shù)發(fā)展, 例如, 由艾博生物、沃森生物和軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院聯(lián)合開發(fā)的ARCov新冠疫苗解決了mRNA疫苗熱穩(wěn)定性差的缺點。流感病毒、寨卡病毒、呼吸道合胞病毒以及狂犬病毒等的預(yù)防性mRNA疫苗也在研發(fā)中。
mRNA藥物用于脫敏療法
mRNA疫苗可用于脫敏療法。注射過敏原進(jìn)行脫敏治療的技術(shù)已經(jīng)較為成熟, 但應(yīng)用對象主要是過敏患者, 應(yīng)用人群小, 且由于過敏原的純化較為粗糙, 在注射過程中可能造成患者對未知組分的過敏反應(yīng)。
面向健康個體的過敏原的預(yù)防性疫苗應(yīng)用人群更大, 需要更高的安全標(biāo)準(zhǔn)。過敏原mRNA疫苗僅表達(dá)單一產(chǎn)物且可被快速清除, 可作為面向一般人群的過敏原預(yù)防性疫苗的一種選擇。其缺點是僅能表達(dá)蛋白類過敏原。Roesler等選擇29種常見過敏原制成mRNA疫苗, 成功在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答。
mRNA藥物用于蛋白替代療法
mRNA蛋白質(zhì)替代療法是指遞送mRNA, 表達(dá)正常蛋白以取代患者缺失的蛋白, 或額外補充功能蛋白, 以預(yù)防或治療疾病。最早的mRNA蛋白替代療法可追溯至1992年, Jirikowski等向血管加壓素基因缺陷的大鼠下丘腦注射血管加壓素mRNA, 緩解了大鼠尿崩癥。
用mRNA替代蛋白進(jìn)行給藥, 有成本低、可通過序列修飾和改變載體改變藥代動力學(xué)參數(shù), 以及產(chǎn)物具有人體中翻譯后修飾形式等優(yōu)點。目前mRNA蛋白替代療法主要通過靜脈注射LNP-mRNA給藥。在動物實驗中, mRNA藥物被證明可用于治療多種酶或其他功能蛋白缺陷導(dǎo)致的遺傳病。
mRNA也可用于表達(dá)生長因子和蛋白類激素, 促進(jìn)細(xì)胞生成和組織再生, 其中VEGF-A mRNA已在2型糖尿病患者中進(jìn)行了試驗, 患者前臂皮內(nèi)接種VEGF-A mRNA后觀察到基礎(chǔ)皮膚血流量增加。
腫瘤治療單抗和感染性疾病預(yù)防單抗是mRNA單抗的主要研究方向, 其中用于預(yù)防基肯孔雅熱的中和mRNA單抗已進(jìn)入Ⅰ期臨床。
mRNA藥物用于基因編輯
遞送編碼核酸酶的mRNA可實現(xiàn)更安全的基因編輯。相比需遞送至核內(nèi)并長期存在的核酸酶DNA序列, 只需遞送至胞質(zhì)的核酸酶mRNA對細(xì)胞損傷小且脫靶風(fēng)險低。已有多項研究向多種哺乳動物個體或胚胎中轉(zhuǎn)入鋅指核酸酶 (ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)和Cas9的IVT mRNA, 實現(xiàn)靶基因的敲除或插入。同時遞送轉(zhuǎn)座酶mRNA和含轉(zhuǎn)座位點的靶DNA, 可實現(xiàn)靶DNA的插入。
mRNA藥物用于細(xì)胞重編程
mRNA在細(xì)胞重編程領(lǐng)域也有應(yīng)用潛力。2006年, 研究發(fā)現(xiàn)一組特定的轉(zhuǎn)錄因子可以將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 (iPSCs)。iPSCs在科研和再生醫(yī)學(xué)和組織工程等領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力, 目前已有基于整合性或非整合性 DNA 載體, 以及非DNA載體的誘導(dǎo) iPSCs的方法。相比DNA載體和蛋白載體, mRNA在避免整合風(fēng)險的同時, 擁有較高的遞送效率。Warren等通過調(diào)整轉(zhuǎn)錄因子mRNA混合物的配比, 使人成纖維細(xì)胞在不依賴于飼養(yǎng)層細(xì)胞的條件下體外重編程為iPSCs。
IVT mRNA療法的安全性考慮
mRNA藥物的安全性考慮主要有序列人工改造導(dǎo)致的不良反應(yīng)、載體納米毒性、mRNA及產(chǎn)物免疫原性、遞送靶向性不足的問題, 以及關(guān)于整合風(fēng)險的爭議等。此外, 缺乏大型哺乳動物試驗數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)也是mRNA藥物面臨的一大問題。
mRNA序列設(shè)計時的一些人工改造可能會導(dǎo)致預(yù)料之外的不良反應(yīng), 例如, 3′UTR的改變有可能影響蛋白產(chǎn)物的定位; 同義密碼子替換可能導(dǎo)致翻譯速率和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點的改變, 從而導(dǎo)致錯誤的翻譯后修飾和翻譯; 核苷修飾可能導(dǎo)致mRNA與蛋白結(jié)合能力改變、損傷內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點, 完全不修飾的核苷酸又具有較高的免疫原性等。因此, 人工設(shè)計的mRNA序列需要經(jīng)過大量的臨床前試驗才能投入應(yīng)用。
遞送mRNA需要用到各類納米載體, 一旦縮小至納米尺寸, 材料更易與生物體發(fā)生相互作用, 造成生物體損傷, 即具有“納米毒性”。納米顆粒的形狀、大小、電荷、親疏水性、組成和暴露途徑都影響其毒性。RNA藥物的納米載體可能存在高密度電荷導(dǎo)致細(xì)胞損傷、難降解的納米載體在溶酶體中積累導(dǎo)致溶酶體過載、與生物體蛋白相互作用導(dǎo)致蛋白功能異常、長纖維干擾染色體導(dǎo)致遺傳毒性以及不良的免疫反應(yīng)等風(fēng)險, 因此需要對載體進(jìn)行優(yōu)化并進(jìn)行足夠的臨床前試驗以保證載體的安全性。
IVT mRNA、載體以及部分翻譯中的副產(chǎn)物具有免疫原性; 產(chǎn)物也可能具有免疫原性。不同的mRNA藥物對mRNA及載體免疫原性的要求不同: 對于疫苗類產(chǎn)品, mRNA及載體適當(dāng)?shù)拿庖咴允怪洚?dāng)自身的佐劑, 更好地激活特異性免疫反應(yīng); IVT mRNA用于抗體療法或蛋白替代療法時, 常常需要長期重復(fù)性給藥, 應(yīng)盡量降低免疫原性。
mRNA自身可能具有免疫原性, 多種模式識別受體可識別RNA, 誘導(dǎo)一型干擾素表達(dá)、炎癥反應(yīng)以及翻譯抑制等。在免疫細(xì)胞中, Toll樣受體家族的TLR3、TLR7和TLR8識別RNA; 在非免疫細(xì)胞中, RNA由RIG-I樣受體家族的RIG-I和MDA5等識別。核苷酸修飾可改變mRNA的免疫原性。mRNA的納米載體可作為疫苗佐劑; 但部分納米粒子有誘發(fā)過敏反應(yīng)、溶血、補體激活及吞噬作用等反應(yīng)的風(fēng)險。
由于mRNA的翻譯在患者自身細(xì)胞中進(jìn)行, 其具有宿主細(xì)胞的翻譯后修飾類型, 理論上翻譯產(chǎn)物的免疫原性低于異種細(xì)胞中表達(dá)的蛋白類藥物。翻譯產(chǎn)物理論上存在誘導(dǎo)抗藥抗體產(chǎn)生的風(fēng)險, 但現(xiàn)有的一些研究并未檢測到抗藥抗體產(chǎn)生?？偠灾? mRNA藥物的免疫原性風(fēng)險需要被重視。
mRNA正確定位至靶器官和細(xì)胞關(guān)系到蛋白的正確表達(dá)和功能的正常發(fā)揮。不同細(xì)胞的翻譯后修飾能力不同，錯誤的翻譯后修飾可能影響蛋白功能; 同一段信號肽在不同細(xì)胞內(nèi)強度不同，未定位至靶細(xì)胞的mRNA的產(chǎn)物分泌效率低, 可能影響劑量敏感性蛋白的功能發(fā)揮。目前mRNA細(xì)胞靶向性遞送的問題尚未完全解決, 在技術(shù)獲得突破前, 上述風(fēng)險可能長期存在, 其影響程度仍需要觀察。在實際應(yīng)用中, 聯(lián)用的藥物是否會影響mRNA的靶向遞送和正確翻譯, 需要進(jìn)一步研究。
mRNA藥物的整合風(fēng)險是公眾關(guān)注的焦點之一。Jaenisch課題組使用體外細(xì)胞系得到了SARS-COVID-2 RNA整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組的結(jié)果, 這一結(jié)果引起了廣泛討論。然而, 體外實驗的結(jié)果并不能完全反映藥物在體內(nèi)的情況, 因為體外實驗更高的mRNA劑量、永生細(xì)胞系分裂活躍導(dǎo)致mRNA可入核 、細(xì)胞系人為導(dǎo)入了未受抑制的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LINE-1(人體多數(shù)細(xì)胞LINE-1被抑制) 以及體外實驗缺乏mRNA清除機制等因素, 導(dǎo)致體外實驗具有更適于RNA整合的環(huán)境。目前仍缺少體內(nèi)用藥導(dǎo)致mRNA整合的證據(jù)。此外, 在mRNA設(shè)計時, 避免整合位點及逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)合位點的出現(xiàn), 可進(jìn)一步降低mRNA的體內(nèi)整合風(fēng)險。因此, 對mRNA藥物的整合風(fēng)險可以予以適當(dāng)關(guān)注, 但mRNA藥物理論上基本無整合風(fēng)險。
mRNA需要在體內(nèi)翻譯后發(fā)揮效應(yīng), 同一段mRNA在不同的靶細(xì)胞內(nèi)可能有不同的翻譯效率和翻譯后修飾, 導(dǎo)致產(chǎn)物的表達(dá)量、結(jié)構(gòu)和功能可能發(fā)生變化, 因此, 人體和動物的試驗結(jié)果相比傳統(tǒng)的蛋白藥物可能有更大的差異。目前mRNA藥物的研究成果多數(shù)仍停留在小型哺乳動物的階段, 研究數(shù)據(jù)不充分。
總而言之, 由于mRNA技術(shù)歷史較短, 其安全性研究尚不充分, 再考慮到動物與人體的差異, 此類藥物在進(jìn)行臨床試驗前需要補充更多的人體細(xì)胞、大型動物和靈長類的研究數(shù)據(jù), 且在人體試驗時應(yīng)以較低劑量起始, 以保障受試者的安全。
mRNA藥物的質(zhì)量控制
mRNA藥物歷史較短, 目前上市或批準(zhǔn)緊急使用的相關(guān)藥物以新冠mRNA疫苗為主, 因此, 目前各類mRNA藥物中, 只有LNP-mRNA疫苗類產(chǎn)品有比較完整的技術(shù)指南。隨著mRNA藥物的研發(fā), 出臺其他類型mRNA藥物的技術(shù)指南很有必要。按照生物制品的定義, mRNA藥物屬于生物制品范疇。Yu等指出, 按現(xiàn)有定義, mRNA 類藥物在我國屬于基因治療制品, 但除用于基因編輯的mRNA藥物以外, 其余 mRNA藥物不會導(dǎo)致宿主細(xì)胞基因組的改變, 因此基因治療制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有部分質(zhì)量控制項目并不適用于mRNA藥物。相關(guān)機構(gòu)需要結(jié)合mRNA藥物的特點出臺新的技術(shù)指南。
藥品質(zhì)量控制的目的是確保藥品質(zhì)量能滿足質(zhì)量要求, 藥品質(zhì)量控制貫穿其研發(fā)、上市和在市面上存在的全過程。從藥物研發(fā)生產(chǎn)流程來看, mRNA 藥物的質(zhì)量控制可分為生產(chǎn)工藝研究、質(zhì)量控制的方法學(xué)研究、藥品穩(wěn)定性研究、藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立、藥品包材的研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、工藝變更等部分。
其他品種mRNA藥物生產(chǎn)過程中的質(zhì)量管理規(guī)范可參考《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的原則, 結(jié)合現(xiàn)有mRNA疫苗以及基因治療制品的相關(guān)指南來進(jìn)行制定。mRNA藥物的生產(chǎn)工藝研究包括目的蛋白的選擇、DNA模板設(shè)計、質(zhì)粒構(gòu)建和菌種庫構(gòu)建, 以及后續(xù)生產(chǎn)過程涉及的轉(zhuǎn)錄模板制備、mRNA原液生產(chǎn)(mRNA轉(zhuǎn)錄與純化)、制劑處方工藝研究(遞送系統(tǒng)與佐劑的研究、mRNA與載體的結(jié)合、產(chǎn)物純化)、結(jié)構(gòu)確證以及除菌過濾以及灌裝等。mRNA藥物生產(chǎn)工藝的研究為質(zhì)量控制的方法學(xué)研究、穩(wěn)定性研究以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的最終制定提供數(shù)據(jù)支持。成品制劑的包材, 以及和產(chǎn)品接觸的耗材, 需要進(jìn)行包材相容性的研究。
隨著mRNA藥物的研發(fā)和生產(chǎn), 其質(zhì)量特性的數(shù)據(jù)逐步積累, 可以進(jìn)行藥物質(zhì)量控制的方法學(xué)研究與驗證, 以供制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和指導(dǎo)完善生產(chǎn)工藝。其他mRNA藥物的方法學(xué)研究可參考mRNA疫苗和對應(yīng)傳統(tǒng)藥物的相關(guān)指南進(jìn)行。應(yīng)針對mRNA的結(jié)構(gòu)和理化特性、遞送載體的結(jié)構(gòu)和理化特性、mRNA與遞送載體的結(jié)合, 以及藥物的生物學(xué)活性等方面選擇關(guān)鍵質(zhì)量屬性并開發(fā)相應(yīng)的檢測方法。相比其他項目, 不同藥物活性檢測方法會有較大差異。
mRNA藥物的穩(wěn)定性是實際應(yīng)用時必須考慮的。在無RNA酶存在的條件下, mRNA本身的穩(wěn)定性較好。建議用方法學(xué)研究過程中形成的藥物質(zhì)量分析方法, 重點分析mRNA藥物在溫度、pH值、光照及濕度變化以及復(fù)溶和反復(fù)凍融的條件下, 關(guān)鍵理化特性和mRNA的表達(dá)效率是否有變化。此外, 企業(yè)應(yīng)進(jìn)行長期留樣試驗?？紤]到已有LNP-mRNA疫苗保存條件的差異, 以及未來mRNA藥物遞送載體進(jìn)一步多樣化的趨勢, 不同產(chǎn)品穩(wěn)定性研究的數(shù)據(jù)可能會有很大差異。穩(wěn)定性研究為確定藥物的儲存和運輸條件提供依據(jù), 為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的最終制訂提供數(shù)據(jù)支持。
隨著mRNA藥物生產(chǎn)、方法學(xué)研究和穩(wěn)定性研究的推進(jìn), 在申報臨床時可初步形成質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn), 在上市階段確定完整的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。mRNA藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)覆蓋 DNA模板、mRNA原液和成品 (有時還需考慮制劑中間產(chǎn)物) 等階段。其他 mRNA藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性, 可參考 mRNA疫苗以及mRNA藥物對應(yīng)的傳統(tǒng)藥物的相關(guān)指南, 結(jié)合藥物研發(fā)的實際情況進(jìn)行確定, 并視情況做出必要修訂。
以下列出mRNA藥物建議的檢定項目：
DNA模板
DNA模板來源于工程菌, 其質(zhì)量控制主要針對所構(gòu)建的質(zhì)量和/或菌種的種子庫進(jìn)行。質(zhì)粒和菌種庫的質(zhì)量控制包括遺傳穩(wěn)定性、菌種的相關(guān)特性鑒定、微生物限度控制、基因序列分析、質(zhì)粒的純度、質(zhì)粒的保有率及產(chǎn)率, 以及質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)等。在進(jìn)行線性化后, 需對 DNA 模板進(jìn)行鑒定, 并檢測其含量、純度、微生物限度和內(nèi)毒素等進(jìn)行檢測, 并對宿主RNA、DNA和蛋白殘留等雜質(zhì)進(jìn)行控制。由于mRNA的測序準(zhǔn)確度低于DNA, 菌種庫、質(zhì)粒及DNA模板的測序應(yīng)予以重視。
mRNA原液
mRNA原液的質(zhì)量控制項目包括含量、mRNA結(jié)構(gòu)分析(鑒別、序列準(zhǔn)確性、序列完整性、加帽率、poly(A)尾長度和修飾比例等)、純度、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)(雙鏈RNA及不完整RNA)、工藝相關(guān)雜質(zhì) (DNA模板殘留、酶殘留及其他)、無菌和內(nèi)毒素等。mRNA結(jié)構(gòu)分析涉及的參數(shù)影響 mRNA 的穩(wěn)定性、翻譯效率和免疫原性, 應(yīng)予以重視。
遞送載體
根據(jù)遞送載體的不同, 生產(chǎn)中可能存在制劑中間產(chǎn)物。例如, LNP-mRNA由脂質(zhì)外殼包裹結(jié)合了陽離子或可電離材料的mRNA, 則結(jié)合可電離材料但未包封的 mRNA可視為制劑中間產(chǎn)物。當(dāng)某檢項對制劑中間產(chǎn)物最敏感, 或是后續(xù)生產(chǎn)步驟需要提供制劑中間產(chǎn)物的質(zhì)量數(shù)據(jù)時, 需要對制劑中間產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量控制, 檢項與成品類似。
藥物成品
mRNA藥物成品的質(zhì)量控制項目包括鑒別、含量(mRNA 含量、完整性、純度; 遞送系統(tǒng)含量; 佐劑與輔料含量)、理化特性 (包括常規(guī)屬性如外觀、裝量、可見異物、不溶性顆粒和滲透壓等; 關(guān)鍵屬性如納米顆粒粒徑、分散系數(shù)、zeta電位和pH等)、復(fù)合率和/或包封率、雜質(zhì)、安全性(無菌、內(nèi)毒素和異常毒性)、生物學(xué)活性。
在mRNA藥物的質(zhì)量控制中, 應(yīng)建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì), 用于儀器校準(zhǔn)、作為工作標(biāo)準(zhǔn)品以及評價質(zhì)量控制方法等。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量特性已經(jīng)準(zhǔn)確定值, 在質(zhì)量控制中, 單獨檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或?qū)⑵渑c待測樣品平行檢測, 可以評價檢測過程的可靠性以及待測樣品檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。mRNA 藥物具有廣闊的發(fā)展前景, 將來會有更多實驗室承擔(dān)藥品各階段的檢驗檢測工作, 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化和結(jié)果的可比性提供重要的標(biāo)尺。
疫苗類制品、血液制品、用于血源篩查的體外診斷試劑等的上市需要批簽發(fā)。mRNA類藥物是否需要批簽發(fā), 應(yīng)根據(jù)使用人群(如疫苗的使用人群為健康人, 使用范圍廣)、生產(chǎn)過程的污染風(fēng)險、產(chǎn)品安全風(fēng)險以及可能造成的社會影響等方面具體考慮。例如, mRNA疫苗類產(chǎn)品應(yīng)進(jìn)行批簽發(fā), mRNA治療性單抗可以考慮不進(jìn)行批簽發(fā)。
隨著技術(shù)發(fā)展和研發(fā)的進(jìn)行, 研發(fā)中產(chǎn)品和已上市產(chǎn)品可能發(fā)生生產(chǎn)工藝的變更。需要對變更前后產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性進(jìn)行可比性分析, 證實變更未對產(chǎn)品的質(zhì)量屬性造成不利影響?？紤]到對mRNA藥物認(rèn)知的有限和藥物的復(fù)雜性, 工藝變更應(yīng)謹(jǐn)慎進(jìn)行, 且變更后應(yīng)充分評估產(chǎn)品質(zhì)量變化。
總結(jié)與討論
mRNA藥物的應(yīng)用前景廣泛。隨著mRNA技術(shù)的發(fā)展, mRNA藥物的序列設(shè)計、遞送系統(tǒng)和給藥途徑都在不斷優(yōu)化。然而, mRNA藥物作為一項新興技術(shù), 還面臨諸多挑戰(zhàn)。在藥物設(shè)計與應(yīng)用方面, 如何提高 mRNA藥物的靶向性, 降低納米毒性和免疫原性是需要考慮的問題。此外, 現(xiàn)有mRNA疫苗的超低溫冷鏈運輸條件影響了產(chǎn)品的可及性, 因此, 如何優(yōu)化藥物設(shè)計, 降低產(chǎn)品儲存運輸成本, 也是制藥者需要努力的方面。
在藥物評價方面, mRNA藥物臨床試驗數(shù)據(jù)不足, 其安全性和人體中的有效性尚有一定爭議, 考慮到體外實驗和體內(nèi)實驗的差異, 以及動物和人體的差異, 需要補充更多的人類細(xì)胞系和臨床試驗數(shù)據(jù)。在藥物質(zhì)量控制方面, mRNA藥物的歷史較短, 目前僅LNP-mRNA疫苗的技術(shù)指南較完善; 隨著mRNA藥物研究的深入, 將來需要完善其他品種mRNA藥物的質(zhì)量控制乃至質(zhì)量管理體系, 從研發(fā)、生產(chǎn)、檢驗和銷售等全方位保障mRNA藥物的安全性和有效性。
參考資料
侯書婷, 于傳飛, 王蘭, 王軍志. 體外轉(zhuǎn)錄mRNA藥物的技術(shù)進(jìn)展和應(yīng)用前景[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2023, 58(8): 2047-2058. doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-0201
京公網(wǎng)安備11010802046783號
