測(cè)定藥物中的有關(guān)物質(zhì)，主要有外標(biāo)法、加校正因子的主成分自身對(duì)照法、不加校正因子的主成分自身對(duì)照法和面積歸一化法等。盡管采用雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)的方法越來越普遍，加校正因子的主成分自身對(duì)照是我們的倡導(dǎo)，但目前使用最多的還是不叫校正因子的主成分自身對(duì)照法和面積歸一化法。
面積歸一化法具有與稱樣量及進(jìn)樣量基本不相關(guān)的特點(diǎn)，因此重復(fù)性良好。需要強(qiáng)調(diào)的是面積歸一化法是假設(shè)所有成分均出峰、所有雜質(zhì)均與主峰分分離并且所有雜質(zhì)均與主成分響應(yīng)因子相同的前提下，其結(jié)果可完全真實(shí)地表明為該物質(zhì)的純度，可畢竟只是假設(shè)，實(shí)際情況可能并非如此。另外當(dāng)雜質(zhì)是微量的時(shí)候，需增加方法的靈敏度，就要增加進(jìn)樣量，此時(shí)主成分可能超出儀器檢測(cè)范圍，或雖然在儀器檢測(cè)范圍內(nèi)，為防止此種情況的出現(xiàn)，才引入“不叫校正因子的主成分自身對(duì)照法”，理論上講不加校正因子的主成分自身對(duì)照法只是改善了可能存在的不在同一線性范圍的問題，面積歸一化法其他的假設(shè)和局限完全相同。
事實(shí)上我們關(guān)注的藥物中的雜質(zhì)一般為百分之幾到千分之幾，與主成分相差幾十至幾百倍，隨著現(xiàn)代液相色譜儀性能的提高，儀器的線性范圍一般達(dá)3個(gè)數(shù)量級(jí)以上，實(shí)際檢測(cè)時(shí)，多數(shù)情況下不會(huì)超出線性范圍，所以歸一化法和不加校正因子的主成分自身對(duì)照法所得結(jié)果往往是基本一致的。所前所述，如果不一致，往往是歸一化法不在線性范圍引起的。因此常常是雜質(zhì)的高估（為高濃度主峰面積的負(fù)誤差引起）。由于不叫校正因子的主成分自身對(duì)照法存在稀釋步驟、進(jìn)樣針和進(jìn)樣閥殘留、進(jìn)樣誤差等影響因素，特別是進(jìn)樣針和進(jìn)樣閥殘留，往往使得雜質(zhì)低估（為自身對(duì)照峰面積的正誤差引起的），如果出現(xiàn)相反情況，應(yīng)懷疑試驗(yàn)中可能有失誤的地方，這種驗(yàn)證往往是有價(jià)值的，也是很方便的，因?yàn)椴⑽丛黾訉?shí)際工作量，只是在主成分自身對(duì)照法完成的同時(shí)充分利用了歸一化法的信息，從而更好保障結(jié)構(gòu)的可靠性。
目前，有一種觀點(diǎn)，認(rèn)為面積歸一化法有弊端，不能用，只有不叫校正因子的主成分自身對(duì)照法才行，這種觀點(diǎn)是片面的，如上所述，不叫校正因子的主成分自身對(duì)照法的優(yōu)點(diǎn)在于解決了可能出現(xiàn)的線性問題。另外，設(shè)計(jì)面積歸一化法時(shí)，為防止主成分峰面積太大，進(jìn)樣量不能太大，進(jìn)樣量不能太多，雜質(zhì)峰可能較小，其峰面積測(cè)定值的相對(duì)誤差就會(huì)較大，理論上講可能造成面積歸一化法誤差偏大，而不叫校正因子的主成分自身對(duì)照法在不影響分離的前提下進(jìn)樣量可適當(dāng)加大，對(duì)小峰面積的準(zhǔn)確測(cè)量有利，除了上述二點(diǎn)，別的就不一定是優(yōu)點(diǎn)了，相反是弊端了。
有文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)面積歸一化法會(huì)因保留時(shí)間差異引起雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果的差異，我們認(rèn)為文中出現(xiàn)的問題很可能是主成分超出了檢測(cè)器的響應(yīng)范圍，從而引起主峰的峰面積不真實(shí)，當(dāng)調(diào)整流動(dòng)相后主峰出峰往后，峰變寬，峰高降低，主峰面積增加了，故而歸一化法的雜質(zhì)測(cè)定值相對(duì)降低了，而不是“由于出峰加快，該雜質(zhì)峰面積變小，而主峰由于峰型拉寬，峰面積有所增加”。理論上講，濃度型檢測(cè)器的峰面積與出峰快慢無關(guān)，只與物質(zhì)的濃度有關(guān)。文中出現(xiàn)的兩法的差異，很可能是主成分太濃了，超出了檢測(cè)器的響應(yīng)。因此在有關(guān)物質(zhì)檢查的方法建立時(shí)，進(jìn)樣量應(yīng)注意優(yōu)化，不是為充分檢出雜質(zhì)，越弄越好，而是應(yīng)適可而止。
當(dāng)然，采用已知雜質(zhì)對(duì)照品法檢測(cè)雜質(zhì)含量，可避免上述問題，特別是雜質(zhì)與主成分響應(yīng)不一致的時(shí)候。另一方面，由于雜質(zhì)對(duì)照品的獲得和供應(yīng)比較困難，在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中是否引入雜質(zhì)對(duì)照品應(yīng)衡量并慎重，采用雜質(zhì)對(duì)照品應(yīng)該是今后努力的方向。下列情況，宜在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定采用雜質(zhì)對(duì)照品。
1、規(guī)定色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)需要?？蓮浹a(bǔ)只規(guī)定理論板數(shù)的不足，既可以是結(jié)構(gòu)已知的雜質(zhì)，也可以是與主成分或已知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)相近的指示性物質(zhì)。
2、該雜質(zhì)與主成分的相對(duì)響應(yīng)因子差異較大（超出0.9~1.1）,時(shí)，自身對(duì)照法不能準(zhǔn)確反映雜質(zhì)的真實(shí)含量。特別是響應(yīng)因子較小的雜質(zhì)，因易低估其含量。
3、該雜質(zhì)的毒性較大，需要專門嚴(yán)格控制。
另外，如果該雜質(zhì)不夠穩(wěn)定，將來供應(yīng)會(huì)有困難，可采用提供含有該雜質(zhì)的藥品粗品或純度不高的雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行雜質(zhì)定位，然后在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用加校正因子或不叫校正因子的主成分自身對(duì)照法為好。
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