聚苯胺（PANi）的導(dǎo)電活性特性使其成為一種很有前途的聚合物，廣泛應(yīng)用于治療，包括傷口護(hù)理和治療。在本研究中，印度卡哈拉格普爾理工學(xué)院Santanu Dhara及其團(tuán)隊(duì)將0.3 wt%的PANI（p）在不含/含F(xiàn)A的高絲纖維蛋白(S)載聚己內(nèi)酯（PCL）纖維，標(biāo)記為BpS和EpS。在不含/含F(xiàn)A溶劑（均相和乳液）的HFIP中，p產(chǎn)生不同的pH（pH-9/3），產(chǎn)生不同形貌的纖維。通過對(duì)BpS和EpS纖維的理化表征研究，確定p在不同溶劑中的組成和作用中聚合物的存在。由BpS纖維（pH 9）制成的電活性“智能”纖維比由EpS纖維（pH 3）制成的纖維機(jī)械性能更穩(wěn)定。使用人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（hPMSCs）來評(píng)估細(xì)胞相容性，在BpS纖維底物上的增殖率明顯高于EpS。同時(shí)還研究了用BpS和EpS纖維處理的全層傷口模型的體內(nèi)評(píng)價(jià)。通過IHC染色、生化分析和RT-PCR了解傷口愈合進(jìn)程中不同階段的各種機(jī)制。與EpS和Tegaderm治療的傷口相比，BpS的機(jī)械強(qiáng)度和電活性性能促進(jìn)傷口愈合和完全閉合。此外，BpS處理的傷口在第7天顯示IL-1β、IFNγ、Col III和EGF基因的高表達(dá)。14天后，BpS處理的傷口TGF-1、Col I和FGF基因表達(dá)增加。因此，BpS治療的傷口顯示出是它一種潛在的具有皮膚重塑功能的傷口敷料。
相關(guān)研究?jī)?nèi)容以“Polyaniline doped Silk fibroin-PCL Electrospunfiber: An electroactive fibrous sheet for full-thickness wound healing study”為題于2023年9月23日發(fā)表在《Chemical Engineering Journal》。
圖1 靜電紡絲溶液的表征
自旋溶液的流變特性呈現(xiàn)出非牛頓流動(dòng)行為（圖1a）。顯微鏡觀察證實(shí)PANi在BpS（均質(zhì)）和EpS（乳液）聚合物混合物中的隨機(jī)分散（（圖1b）。BpS和EpS的FESEM圖像顯示，平均直徑分別為145±5和225±8 nm（圖1c i、iii）。BpS和EpS的TEM圖像證實(shí)了PANi的隨機(jī)分布（圖1c ii、iv）。AFM結(jié)果顯示，在10 μm掃描尺寸下，BpS和EpS纖維的平均表面粗糙度分別為0.80和0.75 μm（圖1d）。
圖2 物理化學(xué)表征
BpS和EpS纖維樣品的FTIR光譜如圖2a所示，BpS和EpS在3270 cm-1（N-H拉伸振動(dòng)）處出現(xiàn)一個(gè)峰值，在1515 cm-1（C=C拉伸）一個(gè)類苯環(huán)和1295cm-1（C−N拉伸）處出現(xiàn)一個(gè)弱峰，表明PANi帶的存在。經(jīng)甲醇處理后獲得BpS和EpS纖維樣品的β sheet轉(zhuǎn)化的拉曼光譜基線校正峰如圖2b所示。BpS和EpS的XRD圖在21.3°和23.6°左右出現(xiàn)一個(gè)衍射峰（圖2c），證實(shí)纖維樣品的結(jié)晶度。通過XPS觀察到BpS和EpS表面有O、N和C的存在（(圖2d）。BpS和EpS靜電紡絲片的DSC如圖2e所示，在兩個(gè)樣品中都觀察到60和400℃左右的兩個(gè)峰。BpS的接觸角高于EpS（圖2g）。
圖3 機(jī)械性能
BpS和EpS甲醇處理樣品的力-延伸曲線證實(shí)，在不同聚合物組成的HFIP中加入PANi對(duì)機(jī)械穩(wěn)定性影響很大（圖3a）。圖3b顯示在BpS和EpS靜電紡絲纖維片表面進(jìn)行的20個(gè)壓痕結(jié)果，證實(shí)BpS的納米力學(xué)穩(wěn)定性。BpS和EpS的模量和硬度均有顯著差異，其中BpS具有較高的納米力學(xué)性能。
圖4 支架的體外鑒定
BpS和EpS電活性纖維樣品在生理溫度下的降解動(dòng)力學(xué)證實(shí)這兩種纖維的逐漸降解（圖4a），與BpS相比，EpS靜電紡絲支架的降解率相對(duì)較高。間隔一定時(shí)間后，通過FESEM成像技術(shù)觀察到支架的降解（圖4ai)。兩種樣品在相似的時(shí)間點(diǎn)并在不到16h時(shí)達(dá)到平衡，BpS的腫脹率略低于EpS（圖4b）。圖4c證實(shí)24 h后BpS和EpS的蛋白吸附動(dòng)力學(xué)存在顯著差異。以上結(jié)果表明BpS的蛋白質(zhì)吸附動(dòng)力學(xué)性能高于EpS。
圖5 細(xì)胞評(píng)價(jià)
hPMSCs在BpS和EpS上的細(xì)胞活力百分比如圖5a所示，BpS纖維的hPMSCs增殖率高于EpS。在BpS和EpS上的3天和5天后觀察到活（綠）-死亡（紅）染色（圖5 b)，BpS纖維的細(xì)胞增殖和粘附優(yōu)于EpS。使用rhod-dapi染色和FESEM下觀察hPMSCs與BpS和EpS通信的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)（圖5 c），在高細(xì)胞增殖和粘附方面，細(xì)胞對(duì)BpS的串?dāng)_優(yōu)于BpS。
圖6 體內(nèi)傷口愈合研究
圖7 體內(nèi)傷口愈合研究
圖8 體內(nèi)傷口愈合研究
在不同的時(shí)間間隔內(nèi)觀察電活性纖維（BpS & EpS）和Tegaderm（對(duì)照組）的全層傷口愈合研究，并對(duì)傷口愈合動(dòng)力學(xué)進(jìn)行評(píng)估（圖6a、b），總體而言，BpS處理的愈合效果優(yōu)于EpS。組織HE染色結(jié)果顯示，BpS處理的傷口在7天內(nèi)顯示可見纖維，再上皮化增強(qiáng)；而EpS顯示傷口中部缺乏表皮覆蓋（圖6d）。BpS處理的傷口在21天內(nèi)整個(gè)傷口顯示完全再上皮化，EpS處理的傷口表面顯示傷口邊緣的再上皮化受限，上皮化程度低于BpS（圖6c）。
使用MT染色評(píng)估不同時(shí)間間隔內(nèi)BpS、EpS和Tegaderm處理的傷口的膠原沉積和模式（圖7a）。與BpS和Tegaderm處理的傷口相比，BpS處理的傷口床顯示纖維結(jié)構(gòu)，膠原含量增加。在21天內(nèi)，BpS呈現(xiàn)出有組織的膠原沉積和完全的表皮再生。在第7、14和21天的傷口切片上觀察到CD31抗體和Dapi染色（圖7b）。到7天，BpS治療的傷口在愈合過程早期傷口床內(nèi)的新血管生成能力增強(qiáng)，在14天內(nèi)下降，證實(shí)傷口閉合，消除瘢痕形成的風(fēng)險(xiǎn)。到第21天，BpS處理的傷口CD31表達(dá)明顯減少，形成成熟血管。
免疫染色結(jié)果顯示，CD68巨噬細(xì)胞在3、7天的存在和數(shù)量在纖維和Tegaderm處理的傷口中均有大量表達(dá)；BpS處理的傷口在第14天顯示CD68標(biāo)記物表達(dá)量減少（圖8 a、b），表明炎癥反應(yīng)減少，促進(jìn)傷口愈合過程。觀察dapi復(fù)染后Col III和Col I的表達(dá)，分析第14、21天傷口愈合過程中的拼貼合成，發(fā)現(xiàn)用BpS、EpS和Tegaderm治療的傷口在第14天的Col III沒有顯著差異。21天后，BpS和EpS傷口處理的Col III表達(dá)顯示新皮膚組織形成呈陽性（圖8 c、d），證實(shí)皮膚完全再生。
圖9 生物化學(xué)分析
BpS、EpS和Tegaderm處理的傷口7、14和21天的羥脯氨酸含量如圖9 a所示，傷口愈合過程中，羥脯氨酸含量總體增加，BpS與EpS和Tegaderm處理的傷口差異顯著。在傷口愈合過程中，己糖胺含量下降，而羥脯氨酸含量增加（圖9b），證實(shí)傷口愈合初期膠原沉積較多，在第21天消退。隨著時(shí)間的增加，MPO活性降低，Tegaderm處理的樣品MPO活性高于BpS和EpS處理的皮膚（圖9c）。在7、14和21天時(shí)，在Tegaderm處理的傷口IL-6的基因表達(dá)更高（圖9iia）。隨著時(shí)間的推移，IL-1β的表達(dá)逐漸下降（圖9iib）。BpS處理的傷口中IFN-γ基因表達(dá)明顯高于EpS和Tegaderm（圖9iid）。TGF-β1基因表達(dá)水平在第14天達(dá)到峰值，在第21天下降至基線水平（圖9iie）。BpS處理的傷口在三個(gè)時(shí)間間隔內(nèi)的Col III基因表達(dá)量均顯著高于EpS和Tegaderm處理的皮膚（圖9iif）。纖維和對(duì)照組的Col I相對(duì)表達(dá)量均在第14天達(dá)到最高，在BpS處理的傷口第14、21天Col I表達(dá)增強(qiáng)（圖9iig）。EGF和FGF基因的相對(duì)表達(dá)量在第7天達(dá)到峰值，并在第21天恢復(fù)到基線水平（圖9iih、i）。綜上，通過RT-PCR分析相對(duì)表達(dá)結(jié)果確定BpS纖維處理傷口的皮膚修復(fù)機(jī)制，接近正常皮膚。
綜上所述，本研究重點(diǎn)研究含有PANi的電紡絲纖維如何影響全層傷口的愈合。在電活性纖維中，一種被稱為BpS的特殊類型表現(xiàn)出顯著的導(dǎo)電性和力學(xué)性能。BpS電紡絲纖維與hPMSCs相互作用增強(qiáng)細(xì)胞的增殖和活力。此外，接種在BpS上的細(xì)胞顯示出細(xì)長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)，表明對(duì)其整體形態(tài)有積極的影響。與使用Tegaderm相比，用BpS電活性纖維處理的傷口在7天后顯示出新血管生成和免疫細(xì)胞反應(yīng)的增加。到第14天，新血管生成和炎癥反應(yīng)均減少，提示早期愈合和瘢痕形成的機(jī)會(huì)減少。BpS處理的傷口顯示Col III和Col I的沉積，以及再上皮化，表明組織修復(fù)和再生加速。到第21天，BpS處理的傷口顯示Col III和Col I染色陽性，表明皮膚完全再生和再上皮化。
生化分析顯示，在傷口愈合過程中，己糖胺含量下降（組織再生的標(biāo)志），羥脯氨酸水平升高（膠原沉積的標(biāo)志）升高，表明膠原在愈合的早期階段積累。基因表達(dá)分析顯示，在BpS治療的傷口中，促炎細(xì)胞因子在第7天下降，到第21天恢復(fù)到基線水平。相反，用EpS和Tegaderm治療的傷口表現(xiàn)出延長(zhǎng)的炎癥反應(yīng)。與其他處理相比，BpS處理的傷口在第21天表現(xiàn)出更高的膠原基因表達(dá)。
本研究結(jié)果表明，BpS“智能”纖維有希望進(jìn)行皮膚重塑，具有早期炎癥反應(yīng)，組織良好和成熟的膠原沉積，以及與天然或正常皮膚非常相似的再生皮膚。在未來的研究中，電刺激的應(yīng)用和各種傳感技術(shù)的應(yīng)用可以被探索用于皮膚組織工程和傷口愈合應(yīng)用的診斷和治療目的。
文章來源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2023.146245
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