本文以實(shí)例，利用方法開發(fā)流程，將高效液相色譜方法開發(fā)變簡(jiǎn)單，讓新手小白也能輕松掌握液相色譜方法開發(fā)能力。
高效液相色譜方法開發(fā)通常耗時(shí)且費(fèi)力。大家常采用的方法是，用已經(jīng)習(xí)慣使用的溶劑、pH條件、緩沖鹽、以及常用色譜柱的組合，作為起始條件，然后對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行一系列的調(diào)整，直至獲得比較滿意的峰形與分離度。但這樣的工作方式通常極為耗時(shí)，而且也并不能獲得最佳分離條件。更為系統(tǒng)性的方法策略，是利用好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并遵循以下流程，進(jìn)行高效、高質(zhì)量的反相色譜方法開發(fā)。這個(gè)方法開發(fā)流程包括：方法篩選：流動(dòng)相pH、有機(jī)溶劑、以及色譜柱，作為對(duì)選擇性影響最大、因而也是最重要的條件因素，首先被加以篩選。方法優(yōu)化：對(duì)以上得到的所有結(jié)果，評(píng)估這三個(gè)因素的何種組合，獲得了最佳分離效果。在這個(gè)組合條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行優(yōu)化或微調(diào)，以獲得最終想要的結(jié)果。方法驗(yàn)證：對(duì)最終的方法進(jìn)行驗(yàn)證，檢查它是否滿足預(yù)期的分離效果與分析目的。
一、啟動(dòng)
為了設(shè)計(jì)一個(gè)有效的測(cè)試方法摸索試驗(yàn)，盡可能多地搜集關(guān)于樣品和被分析物化學(xué)特性的信息是很重要的。
1、方法開發(fā)所需信息
-- 樣品溶解性能
被分析物數(shù)量？需要分離多少分析對(duì)象色譜峰？
-- 化學(xué)結(jié)構(gòu)
功能基團(tuán)？被分析物有何區(qū)別？有無可電離基團(tuán)？電離常數(shù)？pH值如何影響色譜分析？
-- 檢測(cè)
需要或可能采用何種檢測(cè)？被分析物是否有紫外吸收？λmax？
-- 濃度范圍和定量要求
需要多高檢測(cè)水平？需要多大定量限？
-- 樣品基質(zhì)影響
是否有阻礙分離或檢測(cè)的基質(zhì)影響？>>>>
2、方法使用的目的
在開發(fā)一種測(cè)試方法之前，還需要考慮：是否理解和明確了測(cè)試方法的目標(biāo)和使用目的？清楚理解使用目的將有助于確定必須要滿足的性能參數(shù)以及驗(yàn)證方法所需關(guān)鍵參數(shù)？例如可能需要從樣品的所有組分中分離一種對(duì)象被測(cè)物的方法，或者可能需要既能從其它組分中分離對(duì)象被測(cè)物、也能使所有組分之間能夠相互分離的方法。其它考慮因素可能還包括：需要多大通量？需要多大分辨率？可以接受的拖尾因子等。我們采用帕羅西汀有關(guān)物質(zhì)分析方法開發(fā)實(shí)例來展示系統(tǒng)策略。
二、方法篩選
1、pH的影響
當(dāng)分析物含有可電離官能團(tuán)時(shí)（可電離官能團(tuán)指，在不同的pH條件下可處于不同程度的電離狀態(tài)，例如：伯/仲/叔胺基、羧酸基、酚酸基），pH條件將強(qiáng)烈影響分析物的反相保留效果，pH條件的改變也會(huì)造成最強(qiáng)烈的選擇性改變效果。酸性和堿性化合物在其未電離狀態(tài)下時(shí)反相保留最大，中性化合物的保留不受pH影響。
pH是如何影響反相保留性質(zhì)的？對(duì)于可電離化合物，要獲得最強(qiáng)的反相保留，分析物應(yīng)盡可能的不帶電或電離，此時(shí)分析物的極性相對(duì)較小，在反相色譜柱上的保留就更強(qiáng)。因此，酸性化合物應(yīng)使用低pH條件，而堿性化合物更適用高pH條件。中性化合物沒有任何可電離官能團(tuán)，因此，不會(huì)受到pH條件影響。這些點(diǎn)線圖，就好比滴定曲線，與分析物分子pKa值高度相關(guān)。在開發(fā)方法時(shí)，應(yīng)避免在化合物分子的pKa值附近篩選pH條件，否則，pH值的微小變化都會(huì)導(dǎo)致保留和選擇性的劇烈變化。保留曲線的“平臺(tái)區(qū)”是分析方法耐用性較強(qiáng)的區(qū)域。
2、色譜柱的影響
在選擇色譜柱進(jìn)行分析方法開發(fā)時(shí)，應(yīng)充分認(rèn)識(shí)，色譜填料基質(zhì)(硅膠顆粒、雜化顆粒、聚合物顆粒)因其化學(xué)性質(zhì)不同而會(huì)提供不同的保留與選擇效果。
不同的鍵合相，不同的選擇性
疏水性－長(zhǎng)的烷基鏈，提供更強(qiáng)的保留
硅羥基活性－影響色譜峰的對(duì)稱性和次級(jí)相互作用
抗水解穩(wěn)定性－鍵合相(如C18)通過更多的鍵鍵合到基質(zhì)顆粒上
官能團(tuán)的密度－影響載樣量
3、有機(jī)溶劑的影響
甲醇和乙腈，是用于反相分離的典型有機(jī)溶劑。除了洗脫強(qiáng)度、粘度(與柱背壓有關(guān))、紫外吸收性不同，甲醇與乙腈在化學(xué)選擇性上也有所不同，甲醇可以發(fā)生氫鍵作用，因此會(huì)提供顯著不同的選擇性。
甲醇：洗脫能力較弱、質(zhì)子化溶劑，提供氫鍵作用
乙腈：非質(zhì)子化溶劑、洗脫能力較強(qiáng)、粘度較低(柱背壓更低)
有機(jī)溶劑相對(duì)洗脫強(qiáng)度曲線：
實(shí)驗(yàn)圖譜表明，與乙腈相比，甲醇的洗脫能力較弱，因此所有分析物都獲得了更強(qiáng)的保留。但是，對(duì)于這個(gè)應(yīng)用，乙腈提供了更好的分離選擇性。因此，pH 10、色譜柱BEH C18和乙腈的條件組合，就可以用作下一步的優(yōu)化微調(diào)。
三、方法優(yōu)化
有幾個(gè)參數(shù)可以用來調(diào)整或優(yōu)化色譜分離效果。梯度斜率是一個(gè)用來操作以控制保留和選擇性的物理參數(shù)。但是，梯度斜率經(jīng)常在分離度和靈敏度之間做平衡考量。另外一個(gè)可以優(yōu)化的參數(shù)是溫度。每個(gè)化學(xué)過程都受溫度影響，溫度可以提供明顯的不同選擇性。
1、方法優(yōu)化與梯度斜率
更緩的梯度斜率可以提高分離度
降低梯度斜率將降低靈敏度
更陡的梯度斜率可能壓縮色譜峰，經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致分離度的降低
增加梯度斜率將增加靈敏度
改變梯度斜率時(shí)要平衡峰高與分離度的關(guān)系
改變保留與選擇性
2、方法優(yōu)化與溫度
減少流動(dòng)相粘度
降低背壓
如果流速保持常數(shù)，提高分析物的擴(kuò)散
更高的優(yōu)化線速度
改變保留與選擇性
溫度會(huì)影響中間的每一個(gè)化學(xué)過程，例如增加溫度會(huì)降低移動(dòng)相的粘度，如果流動(dòng)速度恒定將導(dǎo)致系統(tǒng)背壓降低，高溫將改變固定相和流動(dòng)相之間的分配速率，然而由于提高了被測(cè)物分散性，會(huì)加快優(yōu)化線性速度。對(duì)溫度變化敏感的化合物，溫度的微小變化都會(huì)導(dǎo)致選擇性發(fā)生獨(dú)特變化。
此例子中，溫度以15 ℃的步幅從30 ℃開始上升到40 ℃和60 ℃，隨著色譜柱溫度增加，組分的分離性能改善，另外被測(cè)物的分散性提高，譜峰更尖銳，色譜柱溫度為60 ℃時(shí)分離效果最佳。
四、分析方法驗(yàn)證
分析方法驗(yàn)證經(jīng)常是由多個(gè)步驟組成的反復(fù)人工過程，需要進(jìn)行大量的色譜測(cè)試，以充分評(píng)估所有八種特性，審視、計(jì)算和管理這些過程獲得的所有數(shù)據(jù)可能具有一定的難度。Empower方法驗(yàn)證管理器采用自動(dòng)化的驗(yàn)證過程，使數(shù)據(jù)審視更加順暢，極大提高了驗(yàn)證過程的效率和可靠性。
方法驗(yàn)證提示
方法驗(yàn)證用于確認(rèn)分析方法的特性能否滿足應(yīng)用要求，驗(yàn)證過程中需要評(píng)估的典型色譜法特性是專屬性、線性、范圍、檢測(cè)限、定量限、準(zhǔn)確度、精度、穩(wěn)定性。
五、結(jié)論
通過使用包括摸索試驗(yàn)和驗(yàn)證的方法可明顯提高色譜測(cè)試方法的開發(fā)效率。設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究包括影響選擇性的多個(gè)參數(shù)，例如固定相、pH值、有機(jī)改性劑，自動(dòng)化運(yùn)行極大加速了測(cè)試方法開發(fā)流程。合理審視數(shù)據(jù)后，完成最終測(cè)試方法經(jīng)常是微調(diào)和優(yōu)化如梯度坡度和溫度等變量的過程。為了保證所開發(fā)的方法能夠滿足應(yīng)用要求，需要使用前面確定的性能參數(shù)對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果－使用Empower方法驗(yàn)證管理器對(duì)帕羅西汀方法的驗(yàn)證結(jié)果如下：
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