骨膜是覆蓋在骨表面的一層柔性組織膜，由外層纖維層和內(nèi)層胚芽層組成，外層纖維層（尤其是在骨干上）具有定向排列的膠原纖維。人們普遍認(rèn)為，骨膜在生理性骨形成和病理性缺損愈合過(guò)程中都是不可或缺的，切除骨膜會(huì)嚴(yán)重影響骨形成。盡管骨膜具有這些重要功能，但在許多臨床病例中，如嚴(yán)重的開(kāi)放性骨折或骨腫瘤切除術(shù)，骨膜的損傷往往不可避免，導(dǎo)致骨膜和骨修復(fù)困難，這成為目前臨床上的一大難題。為了解決這一問(wèn)題，包括手術(shù)療法在內(nèi)的傳統(tǒng)骨膜修復(fù)方法需要自體或異體移植物來(lái)恢復(fù)天然結(jié)構(gòu)和功能；然而，這些方法由于存在可用性有限、供體部位發(fā)病率高和免疫排斥等并發(fā)癥而受到很大限制。因此，具有理想特性（包括適合細(xì)胞粘附和增殖、可模擬膠原纖維的定向表面納米形貌以及易于粘附到骨表面）的工程生物材料在骨膜修復(fù)方面大有可為?；诮M織工程學(xué)的優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)已開(kāi)發(fā)出許多工程骨膜材料，并取得了良好的效果。遺憾的是，大多數(shù)研究忽略了天然骨膜中定向排列的膠原纖維，而定向表面納米形貌的獲得過(guò)去需要使用特定的設(shè)備，如定向電紡絲儀或光刻機(jī)，這增加了額外的成本和時(shí)間消耗。此外，雖然有一些工程骨膜材料具有生物粘附性，但這些材料仍很有限，因?yàn)槿狈σ粋€(gè)完整的修復(fù)策略來(lái)滿足高效骨膜修復(fù)所需的上述三個(gè)方面的要求。因此，新型人工骨膜材料仍急需開(kāi)發(fā)。
受自然界骨膜的定向膠原結(jié)構(gòu)啟發(fā)，來(lái)自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Junyi Che和蔣青團(tuán)隊(duì)提出了一種復(fù)合人工骨膜，其表面有一層含有碳納米管（CNT）的定向納米層，兩端交聯(lián)有粘性聚多巴胺（PDA）水凝膠。只需在水浴中拉伸薄膜，就能快速方便地獲得可模擬骨膜膠原纖維定向排列的定向表面結(jié)構(gòu)。在碳納米管的幫助下，本研究的人工骨膜表現(xiàn)出足夠的機(jī)械強(qiáng)度和理想的定向納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表面，這進(jìn)一步誘導(dǎo)了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）在膜上的定向排列。這些定向的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能表達(dá)更高水平的成骨基因和蛋白，而由此產(chǎn)生的復(fù)合骨膜可通過(guò) PDA 水凝膠在大鼠大規(guī)模腓骨缺損模型中穩(wěn)定固定，最終顯示出良好的骨再生能力。本研究預(yù)計(jì)，所開(kāi)發(fā)的功能性人工骨膜在治療骨與骨膜復(fù)合缺損的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面具有巨大潛力。相關(guān)工作以題為“Artificial Periosteum with Oriented Surface Nanotopography and High Tissue Adherent Property”的文章發(fā)表在2023年9月25日的國(guó)際著名期刊《ACS Applied Materials & Interfaces》。
1. 創(chuàng)新型研究?jī)?nèi)容
受生物材料滿足骨膜修復(fù)過(guò)程前提條件的理想特性的啟發(fā)，本研究提出了一種具有定向表面納米形貌和強(qiáng)骨粘附性的人工骨膜，如圖 1 所示。利用反蛋白石拉伸聚乳酸（PLA）膜后生成定向橢圓結(jié)構(gòu)。此外，碳納米管（CNTs）是一種常用的生物材料，可作為細(xì)胞外基質(zhì)纖維蛋白的生物仿真模擬物，本研究將其涂覆在膜的表面。CNTs的高拉伸柔韌性保證了聚合物反乳白膜在拉伸過(guò)程中復(fù)合膜的完整性，方便快捷地獲得了預(yù)期的膠原纖維樣定向排列結(jié)構(gòu)，這進(jìn)一步誘導(dǎo)了細(xì)胞在膜上播種后的排列。這樣，通過(guò)普通的實(shí)驗(yàn)設(shè)備就能快速方便地制備出模擬骨膜膠原纖維的取向表面納米形貌。為了進(jìn)一步獲得生物粘附性，本研究在膜的兩端制作了受貽貝啟發(fā)的聚多巴胺（PDA）水凝膠，以幫助膜片粘附在病變組織表面。因此，本研究整合了這些功能材料，開(kāi)發(fā)出了一種新型人工骨膜，滿足了整個(gè)骨修復(fù)過(guò)程的所有要求。
圖1 人工骨膜制備示意圖
為了制備具有一層定向納米層表面的人工骨膜（圖 2a），本研究首先制備了單分散的二氧化硅納米粒子，然后在毛細(xì)力和對(duì)流作用下自組裝成有序的陣列結(jié)構(gòu)，為反蛋白膜提供了可靠的模板（圖 2b）。然后將溶于三氯甲烷的聚乳酸滴在二氧化硅納米粒子模板表面，自然干燥后形成固體支架（圖 2c）。然后，用氫氟酸去除納米二氧化硅模板，得到具有反蛋白石結(jié)構(gòu)的多孔聚乳酸膜。在掃描電子顯微鏡（SEM）下，如圖 2d 所示，可以清晰地觀察到一層周期性多孔結(jié)構(gòu)。為了制備取向表面納米層狀結(jié)構(gòu)，在水浴條件下拉伸聚乳酸反乳白膜，得到不同拉伸時(shí)間的膜。拉伸比例越大，膜上的孔隙就越細(xì)長(zhǎng)（圖 2e,f）。據(jù)報(bào)道，碳納米管具有優(yōu)異的導(dǎo)電性和較高的機(jī)械性能；此外，碳納米管的桿狀形狀和納米級(jí)尺寸使其能夠作為細(xì)胞外基質(zhì)纖維蛋白的生物仿生模擬物。因此，本研究在聚乳酸反乳白膜表面引入了 CNTs，以增強(qiáng)骨膜材料的性能。將 CNTs 溶液均勻滴在膜表面并干燥，即可在膜上涂覆 CNTs。最常用的 CNT 定向排列方法是電弧放電和化學(xué)氣相沉積。然而，這兩種方法都需要使用專門(mén)的儀器。本研究發(fā)現(xiàn)了一種無(wú)需特殊設(shè)備就能方便快捷地構(gòu)建定向表面納米層的方法。在水浴條件下對(duì)膜進(jìn)行簡(jiǎn)單拉伸后，與未拉伸的膜相比（圖 2g），CNTs 實(shí)現(xiàn)了定向排列（圖 2h）。最后，將 PDA 水凝膠交聯(lián)到聚乳酸膜的兩端，使復(fù)合膜具有粘附性能，如圖 2i 所示，在原位形成了交聯(lián)的 PDA 網(wǎng)絡(luò)。
圖2 人工骨膜的結(jié)構(gòu)和表征
為了探索添加碳納米管是否能改善聚乳酸反乳白膜的機(jī)械性能，本研究測(cè)試了其機(jī)械性能。結(jié)果表明，涂覆了 CNT 的聚乳酸膜（CNT/6× 組）的楊氏模量高于未涂覆 CNT 的相同拉伸比的聚乳酸膜（6× 組）（圖 3a,b），這表明 CNT 在改善涂覆膜的力學(xué)性能方面具有優(yōu)勢(shì)。隨后，本研究在魚(yú)明膠中加入多巴胺，并用高碘酸鈉交聯(lián)，在 CNT 涂層聚乳酸膜的兩端制備了 PDA 水凝膠（圖 S2 和 S3）。流變特性曲線顯示，PDA 水凝膠具有剪切稀化行為，這表明其在測(cè)量的剪切速率范圍內(nèi)具有穩(wěn)定的流變特性。此外，PDA 水凝膠的儲(chǔ)存模量（G′）明顯大于損失模量（G″），表明 PDA 水凝膠具有高結(jié)構(gòu)性。為了確定 PDA 水凝膠的粘附能力，本研究將人工骨膜固定在支架底部，并將不同重量的人工骨膜粘附在 PDA 水凝膠上。如圖 3c 所示，人工骨膜可承受高達(dá) 10 g 的重量。同時(shí)， PDA 水凝膠與牛骨的搭接剪切應(yīng)力高達(dá) 0.48 N/cm2。由于 PDA 水凝膠具有很強(qiáng)的粘附性，復(fù)合膜在體外應(yīng)用時(shí)能夠牢固地附著在骨組織表面。此外，復(fù)合膜還能保持完整，緊貼組織，甚至能經(jīng)歷彎曲和水浸泡（圖 3d）。這些特性使人工骨膜成為一種堅(jiān)固的組織補(bǔ)片，適合動(dòng)態(tài)和復(fù)雜的生理環(huán)境。
圖3 人工骨膜的機(jī)械性能
研究表明，自然界骨骺中幾乎所有的纖維都是縱向取向的，同樣，片狀骨中也存在高度取向和相互連接的骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。因此，本研究成功制備了可模仿天然骨膜中膠原纖維排列的定向納米表面，并進(jìn)一步分析了定向納米表面對(duì) hBMSCs 生長(zhǎng)的影響（圖 4a）。5 天后，將 hBMSCs 固定并用類磷青霉素/DAPI 培養(yǎng)，以顯示其細(xì)胞骨架和細(xì)胞核。結(jié)果（圖 4b）顯示，hBMSC 微絲在未拉伸的反蛋白膜上（1×組）呈不規(guī)則排列。相反，拉伸膜上的 hBMSC 沿拉伸的縱向廣泛分布。可以清楚地看出，隨著拉伸率的增加，細(xì)胞形態(tài)變得更加細(xì)長(zhǎng)。特別是涂有 CNT 的 6× 拉伸膜上的細(xì)胞排列略好于未涂 CNT 的 6× 拉伸膜，這表明排列整齊的 CNT 可進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞排列的定向性。對(duì)頻率分布和平均取向角的定量分析顯示，隨著拉伸比的增加，hBMSCs 低取向角的頻率分布變高（圖 4c），平均取向角明顯變?。▓D 4d）。此外，CNT/6×組的低取向角頻率分布最高（<20°），平均取向角最小，這表明本研究的功能復(fù)合膜能有效誘導(dǎo)細(xì)胞定向生長(zhǎng)。
圖4 人工骨膜上細(xì)胞的分布和方向
眾所周知，表面形態(tài)和材料硬度會(huì)強(qiáng)烈影響多種細(xì)胞的行為。此外，一些研究表明，排列整齊的納米纖維結(jié)合機(jī)械刺激可引導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞。因此，本研究進(jìn)一步測(cè)試了 CNT/6× 膜能否促進(jìn) hBMSCs 的成骨分化。第 10 天的 Western blot 結(jié)果（圖 5a-d）顯示，6×拉伸組 Col I、RUNX2 和 OPN 的表達(dá)明顯高于 3× 拉伸組，均優(yōu)于未拉伸組。此外，在兩種 6× 拉伸膜中，膜表面涂有 CNT 的組（CNT/6× 組）成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)量稍高。這可能是由于高拉伸比和 CNTs 涂層使膜表面具有更好的定向結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)了細(xì)胞排列，從而促進(jìn)了 hBMSCs 的成骨分化。同時(shí)，CNTs 還增強(qiáng)了膜表面的機(jī)械強(qiáng)度，在一定程度上進(jìn)一步促進(jìn)了 hBMSCs 的分化。免疫熒光染色驗(yàn)證了 OPN 的表達(dá)。如圖 5g 所示，在 6× 組和 CNT/6× 組的細(xì)胞中可以觀察到代表 OPN 的綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度明顯較高，而在拉伸比較低的組中熒光強(qiáng)度要低得多。定量分析顯示，CNT/6×膜的熒光強(qiáng)度約為 1× 膜的 4 倍（圖 5e）。骨組織由平行排列的 Col I 纖維組成，其上沉積有片狀碳酸鹽磷灰石晶體。因此，為了說(shuō)明誘導(dǎo)成骨分化的能力，本研究在21 天后用茜素紅染色法評(píng)估了礦化效果（圖 5f，h）。與未拉伸組或低拉伸比組相比，拉伸 6 倍的膜表面可觀察到更多的鈣結(jié)節(jié)。此外，已有研究證實(shí) CNT 可增強(qiáng) hMBSCs 的成骨分化。同樣，在本研究中，與 6× 組相比，CNT/6× 組表現(xiàn)出更密集的鈣結(jié)節(jié)。這些結(jié)果表明，反乳白聚乳酸膜與高伸長(zhǎng)后的 CNT 涂層相結(jié)合，最有可能促進(jìn)骨分化。
圖5 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化
與之前的研究一樣，為了測(cè)試本研究的人工骨膜在體內(nèi)促進(jìn)骨再生的能力，本研究通過(guò)手術(shù)在大鼠體內(nèi)創(chuàng)建了伴有大面積骨膜損傷的鈣骨缺損模型。腓骨缺損模型中的骨再生是由發(fā)生在骨內(nèi)膜或骨膜下的膜內(nèi)骨化誘導(dǎo)的。而且，腓骨缺損模型是一種非承重模型，可以消除機(jī)械應(yīng)力對(duì)缺損部位再生的影響。因此，本研究選擇腓骨缺損模型來(lái)測(cè)試工程骨膜材料的特性。為了減少對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的傷害，根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組只選擇了含有或不含 CNTs 的 6 倍拉伸聚乳酸逆乳白膜和 PDA 水凝膠。大鼠模型建立后，將不同的骨膜植入并覆蓋在骨缺損部位。通過(guò)三維重建顯微 CT 分析（圖 6a），可以發(fā)現(xiàn) PDA/CNT/6× 組在第 12 周時(shí)新形成骨的面積最大。用 PDA 層處理未拉伸膜（PDA/1× 組）后，幾乎觀察不到新骨形成，這與空白對(duì)照組的結(jié)果相似。CNT/6× 處理也未能有效再生缺損的腓骨，這可能是因?yàn)闆](méi)有 PDA 水凝膠的膜沒(méi)有粘附在缺損部位，從而導(dǎo)致膜移位而失去功效。對(duì)新生骨組織的定量測(cè)量進(jìn)一步證實(shí)，如圖 6b-d 所示，PDA/CNT/6× 組在骨量/組織體積（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁數(shù)目（Tb.N）方面的促進(jìn)作用最好。血紅素和伊紅（H&E）染色顯示 PDA/CNT/6× 組有大量新再生骨組織（圖 6e）。在 CNT/6× 組中，本研究甚至可以發(fā)現(xiàn)膜移位的痕跡，而在復(fù)合膜覆蓋的一側(cè)則觀察到更多新骨形成。此外，通過(guò) MASSON 染色法還可區(qū)分和確定原發(fā)性骨組織和不規(guī)則新骨組織等片狀骨。同樣，與其他處理組相比，PDA/CNT/6× 處理組產(chǎn)生的新骨量最多（圖 6f）。通過(guò) H&E 染色和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行的生物安全性檢測(cè)顯示，各組的器官（心、脾、肝、肺和腎）無(wú)明顯差異（圖 6f），血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明 PDA/CNT/6× 對(duì)大鼠主要器官無(wú)明顯毒性。這些結(jié)果證實(shí)了 PDA 水凝膠以及 CNTs 涂層和定向表面納米形貌在膜固定、模擬天然骨膜的結(jié)構(gòu)和功能以及促進(jìn)骨再生方面的重要作用。
圖6 不同膜促進(jìn)大鼠顱骨缺損再生的評(píng)價(jià)
此外，本研究還檢測(cè)了第 12 周時(shí)新形成骨中成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)。首先，用免疫組化染色法檢測(cè)新形成骨的骨膜中成骨細(xì)胞分泌氧化氮（OCN）的情況。如圖 7a 所示，空白組中觀察到的 OCN 陽(yáng)性成骨細(xì)胞最少，骨膜顏色最淺，而 PDA/1× 組中 OCN 的表達(dá)水平明顯上升。此外，在拉伸膜后，PDA/6× 組和 PDA/CNT/6× 組的 OCN 表達(dá)水平顯著增加，而 PDA/CNT/6× 組的骨膜中 OCN 表達(dá)水平最高，這是由于膠原樣 CNT 纖維和定向表面納米層的共同作用。有趣的是，CNT/6× 膜缺乏有效的固定作用，因此未覆蓋區(qū)域的 OCN 表達(dá)與空白組相當(dāng)，導(dǎo)致骨再生效果不佳。定量結(jié)果顯示，PDA/CNT/6×組的 OCN 表達(dá)量幾乎是空白組的兩倍（圖 7c）。隨后，本研究還進(jìn)行了 OPN 免疫熒光染色，其結(jié)果與 OCN 免疫組化的趨勢(shì)一致（圖 7b，d）。通過(guò)這些結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，PDA/CNT/6×膜通過(guò)有效的膜固定和定向表面納米層析，能有效促進(jìn)骨再生過(guò)程中 OCN 和 OPN 的形成。
圖7 OCN和OPN在新生骨組織中的表達(dá)
2. 總結(jié)與展望
本研究提出了一種新型人工骨膜，它可以附著在缺損區(qū)域并誘導(dǎo)骨再生。本研究使用具有良好生物相容性的聚乳酸（PLA）構(gòu)建了一種具有反蛋白石結(jié)構(gòu)的膜。在表面涂覆 CNTs 后，拉伸該膜以獲得具有一定機(jī)械強(qiáng)度的定向納米顆粒狀表面，從而誘導(dǎo)細(xì)胞定向排列。植入膜表面的 HBMSCs 能沿著納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的方向生長(zhǎng)，與隨機(jī)排列組相比，其成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)更好。膜的兩端都滴上了受貽貝啟發(fā)的 PDA 水凝膠，使膜具有高組織粘附性。最后，本研究的新型骨膜在促進(jìn)體內(nèi)骨缺損修復(fù)方面表現(xiàn)出了卓越的能力。這項(xiàng)研究為再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用開(kāi)發(fā)了一種新型人工骨膜，可為臨床修復(fù)骨膜缺損提供一種新策略。
文章來(lái)源：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsami.3c07561
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