滅活疫苗是指將病原微生物及其代謝產(chǎn)物，利用理化方法處理，使其喪失感染性或毒性而保有免疫原性的一類生物制劑。滅活疫苗可分為滅活的細(xì)菌疫苗和滅活的病毒疫苗，本文所涉及的病毒滅活疫苗包括全病毒滅活疫苗、裂解疫苗和亞單位疫苗等。
病毒滅活疫苗的生產(chǎn)工藝一般分為病毒的擴(kuò)增、滅活、純化和/或裂解。工藝的確定應(yīng)有充分的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，在仔細(xì)調(diào)研相關(guān)理論文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上， 應(yīng)對(duì)工藝步驟進(jìn)行優(yōu)化，為工藝參數(shù)的確定提供依據(jù)。工藝確定后，還要進(jìn)行相應(yīng)的工藝驗(yàn)證。若研發(fā)過(guò)程中涉及工藝變更的，還要進(jìn)行變更前后的可比性研究和驗(yàn)證。
病毒的接種、培養(yǎng)和收獲
需要優(yōu)化的生產(chǎn)工藝主要技術(shù)參數(shù)包括病毒的接種量、感染時(shí)間、病毒的繁殖動(dòng)態(tài)，細(xì)胞基質(zhì)的培養(yǎng)條件、發(fā)酵條件，生產(chǎn)過(guò)程中污染的控制，不同收獲次數(shù)的比較等。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果確定收獲終點(diǎn)，限定收獲次數(shù)范圍。需對(duì)收獲液進(jìn)行全面檢測(cè)，包括病毒滴度、抗原含量、蛋白含量、無(wú)菌試驗(yàn)和支原體檢測(cè)等。如果生產(chǎn)用細(xì)胞基質(zhì)可能引入新的外源因子污染（如非SPF級(jí)雞胚），應(yīng)增加相應(yīng)外源因子的檢測(cè)。
病毒滅活
病毒能否被徹底滅活是滅活疫苗生產(chǎn)工藝研究的重點(diǎn)，因此需對(duì)滅活條件進(jìn)行充分的研究和驗(yàn)證。
1.滅活劑的選擇：常用的滅活劑有甲醛和 β-丙內(nèi)酯等。不同滅活劑的滅活原理不同，在研制新的病毒 滅活疫苗時(shí)，應(yīng)考慮所采用的滅活方法的合理性。
2.滅活工藝：選擇適合的滅活劑后，應(yīng)對(duì)滅活條件進(jìn)行優(yōu)化，如病毒滴度或蛋白濃度/抗原含量、滅活劑的濃度、pH值、作用時(shí)間以及作用溫度、離子強(qiáng) 度等，應(yīng)對(duì)可能影響滅活效果的參數(shù)分別進(jìn)行研究，根據(jù)病毒滅活的動(dòng)力學(xué)變化，綜合各研究的病毒滅活速率和滅活曲線，確定最佳的滅活工藝參數(shù)。
3.病毒滅活方法驗(yàn)證：應(yīng)同時(shí)考慮滅活效果和滅活方法及參數(shù)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響兩方面的驗(yàn)證。需提供病毒滅活驗(yàn)證的詳細(xì)資料?？刹捎妹舾屑?xì)胞盲傳3代，對(duì)每代細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，而且取樣量和接種量應(yīng)具有廣泛的代表性。應(yīng)采用最敏感的檢測(cè)方法來(lái)驗(yàn)證無(wú)活病毒。這些方法應(yīng)該有足夠的靈敏度和可重復(fù)性，每一個(gè)取樣點(diǎn)應(yīng)取雙份樣品，并設(shè)對(duì)照以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性；也可直接采用動(dòng)物法，觀察接種動(dòng)物的存活情況。同時(shí)，還要驗(yàn)證滅活條件對(duì)疫苗抗原含量、效價(jià)等的影響。
純化工藝
病毒通常在細(xì)胞中培養(yǎng)，收獲的培養(yǎng)液除含有病毒外，還含有細(xì)胞蛋白（雜蛋白）、培養(yǎng)中引入的雜質(zhì)等。如果疫苗中含雜質(zhì)量過(guò)多，則會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)或其他不良反應(yīng)。因此，疫苗必須進(jìn)行純化，去除雜質(zhì)。
目前，滅活疫苗通常采用的純化工藝包括超濾、柱層析和/或密度梯度離心等。超濾可去除部分分子量較小的雜蛋白和工藝相關(guān)雜質(zhì)，如滅活劑等，并使收獲液體積大大減小，利于后續(xù)工藝操作。應(yīng)通過(guò)對(duì)雜蛋白及DNA去除率、抗原回收率等的研究選擇不同截留分子量的超濾膜、確定濃縮倍數(shù)。
柱層析和/ 或密度梯度離心為去除宿主細(xì)胞蛋白、DNA等雜質(zhì)的有效步驟，應(yīng)優(yōu)化層析條件，如層析柱類型、上樣量、洗脫液條件等工藝參數(shù)。梯度離心是根據(jù)病毒顆粒的沉降系數(shù)來(lái)分離病毒，通過(guò)對(duì)不同梯度液中的病毒滴度的檢測(cè)來(lái)確定收集病毒的條件。
純化工藝確定后，還要對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)對(duì)各純化步驟對(duì)細(xì)胞基質(zhì)相關(guān)雜質(zhì)、工藝相關(guān)雜質(zhì)（如有機(jī)溶劑、核酸內(nèi)切酶、滅活劑、裂解劑、殘留牛血清等）的去除效果以及對(duì)有效成分的分離純化效果的驗(yàn)證，來(lái)評(píng)估純化工藝的合理性。同時(shí)，還要關(guān)注純化過(guò)程中污染的控制，進(jìn)行中間產(chǎn)物（如超濾液、層 析洗脫液等）細(xì)菌內(nèi)毒素含量及微生物限度的檢測(cè)， 并根據(jù)多批次的生產(chǎn)檢定結(jié)果建立限度標(biāo)準(zhǔn)。
裂解工藝
某些疫苗（如流感病毒裂解疫苗）需進(jìn)行裂解工藝處理。研發(fā)中需要進(jìn)行裂解劑的選擇、裂解工藝的優(yōu)化研究，并進(jìn)行工藝驗(yàn)證。裂解劑的選擇一般應(yīng)遵 循以下原則：
①已應(yīng)用于生物制品或藥品生產(chǎn)的試劑；
②毒性不宜過(guò)高；
③應(yīng)具有較高的溶解病毒膜抗原的能力和較高的收率。
選擇了裂解劑后，應(yīng)對(duì)裂解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，如裂解劑的濃度、底物（如流感病毒）的濃度、作用時(shí)間等。確定參數(shù)時(shí)，除考慮裂解效果外，還應(yīng)考慮裂解劑可能對(duì)疫苗免疫原性的影響。
有文獻(xiàn)報(bào)道，Triton X-100的濃度若高于1. 0%， 裂解時(shí)間超過(guò) 90 min 后，在病毒裂解的同時(shí)，部分血凝素發(fā)生了斷裂，從而影響了疫苗的免疫原性。還應(yīng)注意的是，同一裂解劑對(duì)不同型別的流感病毒毒株的裂解效果不同，因季節(jié)性流感每年都要更換毒株，應(yīng)重新進(jìn)行裂解工藝參數(shù)的優(yōu)化。裂解完成后，要進(jìn)行二次純化，以去除雜蛋白和裂解劑等雜質(zhì)。
工藝驗(yàn)證
工藝驗(yàn)證的目的是確認(rèn)工藝是否有效以及是否具有可重復(fù)性，從而為建立常規(guī)的規(guī)?；a(chǎn)工藝提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)，如質(zhì)量屬性、產(chǎn)品屬性、組分屬性、工藝參 數(shù)、操作參數(shù)和儀器參數(shù)等，企業(yè)應(yīng)保證疫苗上市前其生產(chǎn)工藝的性能，即能始終如一地生產(chǎn)出滿足有關(guān) 特性、含量、純度和效價(jià)等參數(shù)要求的疫苗。這些保證應(yīng)從小試、中試和/或規(guī)模化生產(chǎn)研究的客觀信息和數(shù)據(jù)中得到，是達(dá)到疫苗質(zhì)量保證目標(biāo)的關(guān)鍵要素。
考慮到疫苗研發(fā)的階段性，臨床研究期間難以完成全面的工藝驗(yàn)證（工藝設(shè)計(jì)階段驗(yàn)證、工藝確認(rèn) 階段驗(yàn)證），但仍應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室規(guī)模和 ／或中試規(guī)模的生產(chǎn)過(guò)程連續(xù)性和重復(fù)性的驗(yàn)證，應(yīng)遵循合理的科學(xué)方法和原則，對(duì)某些特定條件進(jìn)行評(píng)估，并對(duì)規(guī)?；a(chǎn)工藝的性能進(jìn)行預(yù)測(cè)。
在申報(bào)生產(chǎn)階段，建議進(jìn)行完整的工藝驗(yàn)證，并應(yīng)符合cGMP條件。應(yīng)考慮規(guī)模化生產(chǎn)設(shè)備的功能性和限制性，以及由一些因素所產(chǎn)生的變異情況，如 不同批次、不同來(lái)源的原材料，不同生產(chǎn)操作者，不同生產(chǎn)環(huán)境條件，不同計(jì)量系統(tǒng)等，以清楚這些典型的規(guī)?；a(chǎn)變量的變化范圍。應(yīng)建立每個(gè)單元操作與總工藝的工藝控制方法，通過(guò)工藝控制，確保疫苗的質(zhì)量在可控的范圍內(nèi)。
工藝控制既包括物料（原料、各工藝產(chǎn)品）的檢測(cè)，也包括設(shè)備的監(jiān)測(cè)，特別是 由于取樣或檢測(cè)的限制，疫苗的屬性不易被檢測(cè)（如病毒的清除或微生物污染）及中間產(chǎn)品和成品不能很 好地鑒別，其影響質(zhì)量的特性參數(shù)不能很好地確定時(shí)，操作參數(shù)限度和在線實(shí)時(shí)的工藝監(jiān)測(cè)對(duì)工藝的控制是尤其必不可少的。
應(yīng)對(duì)整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程中的工藝關(guān)鍵參數(shù)以及過(guò)程控制點(diǎn)進(jìn)行全面分析，特別是數(shù)據(jù)偏離分析。通過(guò)分析，應(yīng)了解是否有變異及變異的來(lái)源，監(jiān)測(cè)變異的存在與程度，理解變異對(duì)工藝以及最終對(duì)疫苗屬性 的影響，使用與工藝和疫苗中出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)相適應(yīng)的方法控制變異。
各階段工藝驗(yàn)證的批次，一般要求按照工藝研究的結(jié)果至少連續(xù)生產(chǎn)3批符合質(zhì)量要求的樣品。
結(jié)語(yǔ)
本文所涉及的病毒滅活疫苗的工藝研究只是一般共性問(wèn)題，不可能包括和適用于所有的病毒滅活疫苗，因此，在病毒滅活疫苗研制和工藝驗(yàn)證中，應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品的具體性質(zhì)和特點(diǎn)，充分考慮特定品種的個(gè)性問(wèn)題，且應(yīng)突出和強(qiáng)調(diào)科學(xué)性。
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