摘要
一、概述
分析方法可以結構化地分解為限度、樣品處理、試驗參數(shù)、計算方法、系統(tǒng)適用性試驗五個組成部分，對于HPLC分析方法，系統(tǒng)適用性試驗是一個非常重要的組成部分，它可以用于評價儀器的靈敏度、進樣重復性或特定組份的分離度是否符合要求，以保證分析方法能夠順利執(zhí)行。如何設計HPLC分析方法系統(tǒng)適用性試驗，是一個值得深入探討的問題。
二、什么是系統(tǒng)適用性試驗？
根據(jù)《中國藥典》2020年版四部0512中關于系統(tǒng)適用性試驗的內(nèi)容為：“色譜系統(tǒng)的適用性試驗通常包括理論板數(shù)、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復性等五個參數(shù)。按各品種正文項下要求對色譜系統(tǒng)進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進行試驗，必要時，可對色譜系統(tǒng)進行適當調(diào)整，以符合要求。”沒有說明系統(tǒng)適用性試驗的概念，本人結合以上內(nèi)容與自身的理解，對系統(tǒng)適用性試驗做出以下定義：“用規(guī)定的方法進行測試，以確認色譜系統(tǒng)能滿足當前檢測的要求。”
從上述的系統(tǒng)適用性試驗的定義可看出，在實際工作中系統(tǒng)適用性試驗是應當首先進行的，如其不符合要求，則不能繼續(xù)進行實驗，應當進行調(diào)整。理由顯而易見，色譜系統(tǒng)不能滿足當前分析的要求，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)是不可信的。
三、如何設計HPLC分析方法的系統(tǒng)適用性試驗？
3.1 什么時候進行系統(tǒng)適用性試驗設計？
應該在分析方法開發(fā)階段進行系統(tǒng)適用性試驗的設計，主要是基于對方法性能的理解評估系統(tǒng)適用性試驗的五個參數(shù)的風險，制定測試的方法考察其中的高風險因素。
3.2 理論板數(shù)風險評估
液相色譜法已經(jīng)發(fā)展多年，理論與硬件均已較為完善，一般來說一個設計良好的HPLC分析方法的理論板數(shù)均比較高（＞10000），這種情況下一般理論板數(shù)下降導致方法性能不符合要求的風險相對較低，可以不必考察該參數(shù)。
某些特殊情況下如柱效下降較快、理論板數(shù)較低（＜5000），理論板數(shù)的下降可能導致方法性能如分離度、靈敏度、精密度等不符合要求的風險較高，需要考察該參數(shù)；但是制定理論板數(shù)的考察要求有一個難以克服的障礙是很難確定可接受的理論板數(shù)，因為在方法開發(fā)期間理論板數(shù)一般均符合要求，而理論板數(shù)的下降是一個隨時間推移的漸進過程，在短時間內(nèi)難以根據(jù)試驗結果確定可接受的值；因此在系統(tǒng)適用性試驗考察理論板數(shù)現(xiàn)在越來越少見。
與理論板數(shù)下降相關的系統(tǒng)適用性試驗設計做法一般如下：
● 理論板數(shù)下降→峰形異常/分離度下降/靈敏度下降→系統(tǒng)適用性試驗中考察拖尾因子/分離度/靈敏度等直接相關的參數(shù)。
● 理論板數(shù)下降→對方法性能影響不明顯→規(guī)定系統(tǒng)適用性試驗的理論板數(shù)不低于2000。
3.3 分離度風險評估
● 如果在方法開發(fā)期間發(fā)現(xiàn)主成分、主要受控雜質(zhì)存在較近的相鄰峰，需評估由于柱效下降、儀器差異、流動相性能差異等因素導致的分離度風險。一般基于充分的耐用性研究數(shù)據(jù)評估該風險：
● 耐用性研究各數(shù)據(jù)均分離良好，目標峰相隔很遠，分離度風險低，無需考察分離度的系統(tǒng)適用性。
● 如在耐用性研究中發(fā)現(xiàn)分離度存在明顯下降，甚至是不符合要求的情況，則認為方法的分離度風險較高，經(jīng)過充分優(yōu)化方法相關參數(shù)后（首選）仍然存在該風險的，應當制定相關系統(tǒng)適用性試驗考察方法。
● 對于存在多個組分的情況，一般可以只評價分離度風險最高（分離度最差或下降最明顯）的兩個組分。
對于上述風險評估可分為兩種情況進行討論：
1)為研究用方法，不收載于質(zhì)量標準中。這種方法使用的周期短，可以在確保方法驗證符合要求的情況下制定較低的要求，如雜質(zhì)間的分離度不小于1.2。
2)方法收載于質(zhì)量標準，將在產(chǎn)品漫長的全生命周期中用于控制產(chǎn)品的質(zhì)量。此類方法應當在方法開發(fā)階段確認具有非常好的分離度（本文不提出具體數(shù)值，筆者建議應至少基線分離并有明顯的間隔），使其能經(jīng)受數(shù)十年中各種變化（如儀器品牌型號、色譜柱批間差異、試劑來源等）帶來的挑戰(zhàn)。分離度的系統(tǒng)適用性要求可以參考藥典，規(guī)定為不小于1.5。
考察分離度的系統(tǒng)適用性試驗溶液一般采用對照品制備；對于考察主成分與降解雜質(zhì)分離度的情況，也可以采用主成分對照品降解制得。
3.4 度風險評估
雜質(zhì)檢測方法如有關物質(zhì)、殘留溶劑等在方法開發(fā)期間需要評估方法的靈敏度風險。在方法開發(fā)期間可以根據(jù)100%限度相當?shù)膶φ掌啡芤盒旁氡然螂s質(zhì)定量限數(shù)據(jù)評估方法的靈敏度，方法如下：
● 研究方法的靈敏度相關數(shù)據(jù)的儀器靈敏度不宜過高，建議采用實驗室靈敏度中等或較低的儀器。
● 如果限度濃度響應非常高，例如信噪比500以上，一般可認為方法的靈敏度風險低，無需考察。
● 如果限度濃度響應較低，如信噪比50，則認為方法的靈敏度存在較高的風險（不同儀器間靈敏度有差異），需要考察。
● 方法的靈敏度應當符合雜質(zhì)控制策略的要求，如某雜質(zhì)多批次檢測結果均低于限度的10%經(jīng)研究認為風險較低不進行常規(guī)控制，則系統(tǒng)適用性試驗的靈敏度考察應確保相應方法的該雜質(zhì)10%限度的信噪比不小于10。
● 一般采用主成分對照品溶液評估方法的靈敏度，應當對比不同雜質(zhì)與主成分的靈敏度差異制定相關要求。如上文該雜質(zhì)10%限度的信噪比為20，同等濃度的主成分信噪比為40，為確保雜質(zhì)10%限度的信噪比不小于10，系統(tǒng)適用性試驗中應規(guī)定同等濃度的主成分信噪比不小于20。如果靈敏度差異不能建立簡單的換算關系，則應基于研究數(shù)據(jù)制定較為保守的要求。
3.5 拖尾因子風險評估
拖尾因子一般用于考察主成分峰，因拖尾因子的惡化可能導致與相鄰峰的分離度變差，也可能導致響應值誤差較大。它存在與理論板數(shù)同樣的障礙，它也是一個隨時間推移的漸進過程，在短時間內(nèi)難以根據(jù)試驗結果確定可接受的值。同樣在系統(tǒng)適用性試驗中較為少見。一般可以通過分離度、進樣精密度等方法等直接參數(shù)評估拖尾因子的惡化導致的問題。
3.6 重復性風險評估
系統(tǒng)適用性試驗的重復性主要用于評估高精密度方法（如含量測定）的進樣誤差；相對來說允許較大誤差的雜質(zhì)檢測方法重復性風險較低，一般不進行考察。研究方法如下：
● 首先確認分析方法允許的誤差，該誤差為總誤差，包括儀器進樣、樣品配制、樣本屬性等多個來源的誤差。
● 計算總誤差中分配給儀器進樣的誤差。
● 根據(jù)允許的儀器進樣誤差計算連續(xù)進樣5次或6次的RSD可接受標準。
●如果實際儀器進樣誤差遠小于計算值，例如計算得出的連續(xù)進樣 5次RSD可接受標準為0.8%，實際值（綜合耐用性、精密度數(shù)據(jù)）均不大于0.2%，儀器連續(xù)進樣誤差風險較小，無需考察。
● 如果實際儀器進樣誤差接近計算值，例如計算得出的連續(xù)進樣5次RSD可接受標準為0.8%，實際值為0.5%~0.6%，儀器連續(xù)進樣誤差存在較大風險，應當考察。
注意系統(tǒng)適用性試驗的重復性要求不建議不經(jīng)評價地直接使用藥典推薦的值（2%）。詳細內(nèi)容請關注本人的HPLC分析方法開發(fā)相關課程，如藥視網(wǎng)公眾號的“HPLC方法開發(fā)高手養(yǎng)成計劃”或其他線下課程。
四、范例
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參數(shù)
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分析方法
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分析結果（范例）
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理論板數(shù)
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將耐用性研究項下的理論板數(shù)數(shù)據(jù)匯總，找出最小值，求出均值。
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理論板數(shù)的最小值為9212，遠大于液相2000的理論板數(shù)要求，該參數(shù)風險非常小，可不考察
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分離度
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將耐用性研究項下數(shù)據(jù)匯總，一般為主峰與相鄰已知雜質(zhì)的分離度數(shù)據(jù)
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耐用性研究項下主峰與相鄰已知雜質(zhì)峰分離度均大于5，在降解試驗中發(fā)現(xiàn)高溫、酸破壞試驗中均有與主峰分離度2左右的降解雜質(zhì)峰，暫定取對照品高溫破壞作為系統(tǒng)適用性試驗方法。
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靈敏度
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列出各組分定量限驗證數(shù)據(jù)
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各定量限濃度均低于限度的1/20，靈敏度風險較低，可不考察
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拖尾因子
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列出耐用性研究項下供試品溶液與對照溶液主峰拖尾因子的數(shù)據(jù)，評估對分離度與積分準確性的影響
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耐用性研究項下供試品溶液主峰拖尾因子均在1.4-1.6之間，分離度均大于2，對照溶液主峰拖尾因子均不大于1.2，連續(xù)5針主峰峰面積RSD%均小于0.5%，該參數(shù)風險較小，可不考察。
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重復性
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列出耐用性研究項下對照溶液進樣精密度RSD數(shù)據(jù)
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見拖尾因子分析結果，因有關物質(zhì)檢測結果允許誤差較大，該參數(shù)風險較小，可不考察。
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總結
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系統(tǒng)適用性試驗溶液：取****對照品適量，加稀釋劑制成每1ml約含**mg的溶液，置水浴中加熱4小時，取出，放冷，作為系統(tǒng)適用性溶液。
判斷標準：主峰與相鄰降解雜質(zhì)峰的分離度應不小于1.5。
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其他檢測項目可根據(jù)實際情況參考上述方法制定相應的系統(tǒng)適用性試驗。
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