目前的方法未能充分地在皮膚組織工程模型中引入復(fù)雜的附件結(jié)構(gòu)，如毛囊。近日，美國(guó)倫斯勒理工學(xué)院Pankaj Karande及其團(tuán)隊(duì)報(bào)道了使用3D生物打印將這些結(jié)構(gòu)納入工程皮膚組織。由打印皮膚乳頭細(xì)胞（DPCs）和人臍靜脈細(xì)胞（HUVECs）誘導(dǎo)的球狀體，被精確地打印在含有成纖維細(xì)胞的預(yù)凝膠真皮層中。由此產(chǎn)生的組織在成熟時(shí)形成毛囊樣結(jié)構(gòu)，在角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞的遷移支持下，它們的形態(tài)和組成與天然皮膚組織非常相似。重建模擬天然附件結(jié)構(gòu)的復(fù)雜皮膚模型作為移植物和療效模型來(lái)測(cè)試化合物的安全性可以對(duì)再生醫(yī)學(xué)產(chǎn)生重大影響。
相關(guān)研究?jī)?nèi)容以“Incorporation of hair follicles in 3D bioprinted models of human skin”為題于2023年10月13日發(fā)表在《Science Advances》上。
圖1 由不同細(xì)胞組成產(chǎn)生的復(fù)雜3D生物打印球狀體的大小
圖2 由不同細(xì)胞組成生成的復(fù)雜3D生物打印球狀體的表征
本研究將HUVECs、人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HEKs）和人表皮黑素細(xì)胞（HEMs）以及DPCs一起納入研究，形成球狀體。評(píng)估由三種不同的細(xì)胞組合組成的球狀體，如1型（僅DPCs）、2型（DPCs、HEKs、HEMs比例為10：20：2）和3型（DPCs、HEKs、HEMs、HEVECs比例為10：20：2：1）。僅DPCs的球狀體從播種到第7天的直徑減少（圖1）。第4天在球狀體2和3中加入HEKs和HEMs誘導(dǎo)聚集體的增大。
培養(yǎng)7天后，觀察到球狀體3和4可重復(fù)形成圓形和對(duì)稱的球形聚集物（圖2A、B），而球狀體5導(dǎo)致細(xì)胞不對(duì)稱聚集和分散結(jié)構(gòu)（圖2C）。組織學(xué)圖像顯示，球狀體4與球狀體3核心的形態(tài)學(xué)相似（圖2A、B、D、E）。球狀體5的組織學(xué)特征證實(shí)結(jié)構(gòu)的對(duì)稱性和順序的缺乏（圖2F）。在球狀體3中，細(xì)胞角蛋白14（CK14）和CK10局限于鞘內(nèi)（圖2P、M），而在球狀體5中，它們?cè)谡麄€(gè)結(jié)構(gòu)中染色較差（圖2R、O），尤其是CK10。在球狀體4中，未檢測(cè)到這些蛋白，這與該模型中HEKs的缺失相一致（圖2Q、N）。CK5是毛囊外根鞘中HEKs的標(biāo)記物，在球狀體3型核心周圍的表皮細(xì)胞鞘中呈強(qiáng)陽(yáng)性（圖2J），而在球狀體4中完全不存在（圖2K）。CK15通過(guò)來(lái)自上皮組織基底層的HEKs與CK5和CK14共表達(dá)，其表達(dá)與毛囊干細(xì)胞有關(guān)，在本研究模型中，檢測(cè)到了CK15在球狀體3核心（圖2S）和球狀體5核心（圖2U）的表達(dá)。表明在球狀體3中核心細(xì)胞最有可能是DPCs，保留一些干細(xì)胞特征。然后在球狀體3和4中檢測(cè)到IV型膠原，但在球狀體5中沒(méi)有檢測(cè)到（圖2G-I），表明適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)組織可能對(duì)該蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響。
圖3 皮膚內(nèi)毛囊的3D生物打印
圖4 結(jié)合毛囊的3D生物打印皮膚模型的特征分析
為了用毛囊單位重建皮膚，將由DPCs和HUVECs組成的毛囊生物墨水打印在交聯(lián)的真皮層內(nèi)，并嵌入HDFs（圖3A）。在真皮中打印毛囊生物墨水48小時(shí)后，觀察到樣品表面都含有細(xì)胞柱形成（圖3B）。在本實(shí)驗(yàn)中，毛囊生物墨水由DPCs、HUVECs、HEKs和HEMs組成。HEM為結(jié)構(gòu)提供色素沉著，便于柱的視覺(jué)觀察。因此，雖然細(xì)胞不能像球狀體3型那樣排列成同心層，但在最初的實(shí)驗(yàn)中，采用這種方法來(lái)促進(jìn)結(jié)構(gòu)的宏觀觀察。
基底層HEKs向角質(zhì)層的角質(zhì)細(xì)胞漸進(jìn)形態(tài)轉(zhuǎn)變（圖4A）。毛囊結(jié)構(gòu)的形態(tài)與天然組織相似，外根鞘和內(nèi)根鞘圍繞著一個(gè)致密的核心（圖4B）。IV型膠原的染色突出真皮-表皮交界處連續(xù)線的發(fā)展，部分輪廓毛囊結(jié)構(gòu)（圖4F）。CK10和CK14都均勻地存在于整個(gè)表皮中，CK10朝向結(jié)構(gòu)核心，模仿內(nèi)根鞘（圖4C），而CK14主要朝向毛囊的外部區(qū)域（圖4E）。CK15在表皮基底層和毛囊上層通過(guò)HEKs表達(dá)（圖4D）。在整個(gè)表皮和毛囊的HEKs中都檢測(cè)到CK5（圖4G），且在DPCs和HUVECs的核心周圍檢測(cè)到更強(qiáng)的表達(dá)。在表皮上層檢測(cè)到聚絲蛋白（圖4H），與人類皮膚相似。在DPCs和HUVECs球狀體周圍的表皮鞘的內(nèi)層也發(fā)現(xiàn)該蛋白，表明這些表皮細(xì)胞正在向結(jié)構(gòu)的核心分化。在毛囊核心的中央底部區(qū)域檢測(cè)到了ALP（圖4I）。
綜上，本研究能夠使用3D生物打印技術(shù)自動(dòng)重建一個(gè)復(fù)雜的人類毛囊模型。該方法產(chǎn)生一個(gè)具有同心細(xì)胞層的結(jié)構(gòu)，模擬人類毛囊的3D組織。該模型可作為高通量篩選物質(zhì)對(duì)毛囊細(xì)胞的潛在毒性或再生潛力的有用工具。在這項(xiàng)工作中還證明了僅使用人類原代細(xì)胞就可以生成一個(gè)包含毛囊結(jié)構(gòu)的完全3D生物打印皮膚模型。值得注意的是，作為對(duì)以往毛囊再生方面努力的改進(jìn)，3D生物打印方法不僅可以支持分離球體的制造，而且可以重建具有增強(qiáng)分辨率、速度和靈活性的皮膚模型。這項(xiàng)概念驗(yàn)證工作讓我們能夠更好地理解3D生物打印技術(shù)在皮膚內(nèi)開(kāi)發(fā)其他3D復(fù)雜結(jié)構(gòu)方面的潛力和適用性，如血管系統(tǒng)、汗液和皮脂腺。此外，本文提出的方法可能會(huì)極大地影響毛囊模型的生成方式，并可能影響再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以及化妝品和制藥行業(yè)的安全性和有效性評(píng)估。
文章來(lái)源：DOI: 10.1126/sciadv.adg029
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
