一、研究背景
天然細(xì)胞外基質(zhì)由多種蛋白質(zhì)組成，具有相互連接的分層結(jié)構(gòu)，是引導(dǎo)組織組裝的理想材料。然而，這些基質(zhì)的體外使用受到批次間變異性和免疫原性問題的影響。因此，發(fā)現(xiàn)合成替代品仍然是細(xì)胞生物學(xué)家和組織工程師的主要目標(biāo)。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，由自組裝合成肽組成的水凝膠因起始材料的一致性、合成的簡(jiǎn)易性、生物可降解性和低細(xì)胞毒性而受到廣泛關(guān)注。這些合成水凝膠的設(shè)計(jì)目的是形成肽納米纖維的糾纏網(wǎng)絡(luò)，模擬天然基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，包括網(wǎng)眼尺寸、孔徑和納米纖維結(jié)構(gòu)。
新的肽水凝膠支架通常是通過對(duì)超短疏水肽（2-5 個(gè)殘基）進(jìn)行官能化而設(shè)計(jì)的，這些肽具有大的 N-末端封端基團(tuán)，可通過活塞堆積相互作用促進(jìn)自組裝。肽兩親性化合物是另一類凝膠劑，依靠疏水和親水結(jié)構(gòu)域的排列來(lái)驅(qū)動(dòng)自組裝。自互補(bǔ)離子凝膠劑通常由較長(zhǎng)的多肽（8-16 個(gè)殘基）組成，其帶電氨基酸交替排列，通過靜電作用進(jìn)行自組裝。另一種方法是合理設(shè)計(jì)肽序列，模仿天然存在的二級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，如α螺旋或β薄片。盡管對(duì)超分子肽組裝進(jìn)行了廣泛的研究，但發(fā)現(xiàn)新的水凝膠劑的動(dòng)力往往來(lái)自偶然性或?qū)σ延心z劑序列的排列組合。
色氨酸拉鏈（Trpzip）是一種相對(duì)尚未開發(fā)的組裝基序。該基序的特點(diǎn)是四個(gè)交叉鏈色氨酸殘基通過吲哚環(huán)相互鎖定，將多肽折疊成β發(fā)夾構(gòu)象。由于這種高度穩(wěn)定的拉鏈效應(yīng)，Trpzip 肽可以形成短至 12 個(gè)氨基酸的β發(fā)夾。這比以前報(bào)道過的β-發(fā)夾水凝膠劑（如 MAX 肽）要短得多，后者依靠四肽（-VDPPT-）單元和較長(zhǎng)的序列（>20 個(gè)氨基酸）來(lái)維持折疊發(fā)夾結(jié)構(gòu)。以前的工作表明色氨酸有望成為自組裝水凝膠的構(gòu)件；然而，這些系統(tǒng)仍然依賴于結(jié)合使用其他非天然疏水分子（如苯或萘殘基）或常規(guī)的肽凝膠基團(tuán)（如二苯基丙氨酸）來(lái)幫助驅(qū)動(dòng)凝膠化。雖然 Trpzip 序列僅在數(shù)周內(nèi)就能組裝成納米纖維，但其作為一種新的自組裝結(jié)構(gòu)基序的潛力是顯而易見的。不過，Trpzip 肽基序尚未用于形成水凝膠。
二、研究成果
在這項(xiàng)工作中，新南威爾士大學(xué)Kristopher A. Kilian教授團(tuán)隊(duì)利用分子動(dòng)力學(xué)模擬設(shè)計(jì)了一種基于 Trpzip 基序的多肽水凝膠劑。他們的 Trpzip 肽能在幾分鐘內(nèi)分層組裝，首先形成長(zhǎng)納米纖維，然后組裝成具有周期性結(jié)構(gòu)的微尺度結(jié)構(gòu)域。由此產(chǎn)生的水凝膠顯示出具有可調(diào)模量、自愈合和應(yīng)力松弛特性的熱膨脹性凝膠，即使沒有細(xì)胞粘附基序，也能保持細(xì)胞活力和擴(kuò)散性，并具有抗菌活性。添加短粘附肽對(duì)水凝膠的機(jī)械特性影響極小，而添加細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（如層粘連蛋白）則可培養(yǎng)成體干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的腸器官組織。該材料的低屈服應(yīng)變有利于在剪切力作用下快速流化，提供了一種簡(jiǎn)單的機(jī)制來(lái)回收嵌入的細(xì)胞和組織，并通過注射器分散含有細(xì)胞的 Trpzip 凝膠，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞遞送和生物打印應(yīng)用。相關(guān)研究工作以“Hierarchical assembly of tryptophan zipper peptides into stress-relaxing bioactive hydrogels”為題發(fā)表在國(guó)際頂級(jí)期刊《Nature Communications》上。祝賀！
三、圖文速遞
圖1. 通過粗粒度分子動(dòng)力學(xué)模擬識(shí)別易發(fā)生納米纖維聚集的 Trpzip 序列
Trpzip 肽基序能夠合成迄今為止報(bào)道的最短β發(fā)夾（圖 1a）。Trpzip 肽的設(shè)計(jì)初衷是為了研究蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)，但事實(shí)證明，Trpzip 肽序列的微小變化就能極大地改變聚集和納米纖維的形成（圖 1b）。
他們對(duì)所有二十種 Trpzip1 肽變體進(jìn)行了 MD 模擬，并對(duì)每次模擬的最后一幀進(jìn)行了目測(cè)評(píng)估（圖 1c）。通過從每次模擬中提取最大的多肽聚合體并將它們排列在同一軸上來(lái)比較所有變體，他們發(fā)現(xiàn)與原始序列相比，纈氨酸取代的聚合模式差異最大（圖 1d），他們將其命名為 Trpzip-V。量化所有 20 個(gè)變體的最大肽簇的慣性矩證實(shí)，纈氨酸取代的變體形成的大聚集體在形態(tài)上最具纖維性，而 Trpzip1 則形成小球形聚集體（圖 1e）。
圖2. Trpzip 水凝膠的合成、優(yōu)化和表征
圖3. Trpzip 水凝膠的力學(xué)特征
為了評(píng)估 Trpzip 水凝膠的機(jī)械特性，他們對(duì)不同肽濃度的凝膠進(jìn)行了原位振蕩平行板流變儀測(cè)試。Trpzip 水凝膠的硬度隨肽含量的增加而增加，G'值范圍為 1-60 kPa，所有凝膠在大約 12 小時(shí)后達(dá)到平衡儲(chǔ)存模量（圖 3a）。Trpzip 凝膠的凝膠化行為與溫度有關(guān)，37 °C 時(shí)的硬度比 20 °C 時(shí)高十倍（圖 3b）。令人驚訝的是，Trpzip 凝膠的屈服點(diǎn)出現(xiàn)在剪切應(yīng)力約為 75 Pa 時(shí)（圖 3c）。這與他們觀察到的凝膠在中等壓力下快速流化的現(xiàn)象一致。Trpzip 凝膠還表現(xiàn)出剪切稀化行為（圖 3d），粘度與剪切率成正比線性下降，這表明它可能是擠壓和生物制造的理想生物材料。由于其他肽水凝膠可以可逆地組裝和分解其物理交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，他們對(duì) Trpzip 凝膠進(jìn)行了觸變性測(cè)試，以確定它們?cè)诩羟泻蟮淖晕倚迯?fù)和恢復(fù)速度。在 5%應(yīng)變下暴露 5 分鐘后，水凝膠會(huì)在剪切力停止后立即重新交聯(lián)，并在一小時(shí)內(nèi)恢復(fù)到初始硬度（圖 3e）。
天然組織的一個(gè)重要方面是能夠顯示出應(yīng)力松弛等非線性粘彈性特性，這對(duì)于分散組織擴(kuò)張和形態(tài)形成過程中產(chǎn)生的細(xì)胞力至關(guān)重要。為了評(píng)估 Trpzip 凝膠是否具有類似的應(yīng)力松弛曲線，他們進(jìn)行了恒定剪切變形測(cè)量（圖 3f），并將 Trpzip 凝膠（1% w/v）的應(yīng)力松弛半衰期與天然基質(zhì) Matrigel 和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEG-DM）水凝膠進(jìn)行了比較。不出所料，PEG-DM 因其共價(jià)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)而幾乎沒有應(yīng)力松弛；然而，由于其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，Trpzip 凝膠顯示出與 Matrigel 相似的應(yīng)力松弛曲線。他們發(fā)現(xiàn) Trpzip 凝膠的應(yīng)力松弛半衰期（58.5 ± 0.4 秒）低于 Matrigel（87.1 ± 0.76 秒）（圖 3g），但在其他天然基質(zhì)的范圍之內(nèi)。天然材料的另一個(gè)重要方面是細(xì)胞粘附基序的存在。他們研究了在 Trpzip 水凝膠中添加層粘連蛋白衍生的 Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) 粘連基序的效果。與純 Trpzip 凝膠相比，將 Trpzip-IKVAV（200 μΜ）整合到 Trpzip 凝膠中不會(huì)導(dǎo)致硬度發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著變化（圖 3h）。
圖4. Trpzip 水凝膠支持細(xì)胞生長(zhǎng)、注射器擠壓、生物制造，并具有抗菌特性
圖5. 與 Matrigel 相比，在 Trpzip 水凝膠中培育成體干細(xì)胞衍生的腸器官組織
四、結(jié)論與展望
他們的工作展示了一種基于色氨酸拉鏈基序的多肽水凝膠，它能自組裝成具有獨(dú)特機(jī)械和生物特性的納米和微結(jié)構(gòu)材料。Trpzip 水凝膠很容易形成，無(wú)需嚴(yán)格的溫度控制，這通常是天然基質(zhì)所需要的。這種材料的模量可調(diào)，屈服應(yīng)力低，是首例可改變粘彈性的材料，可通過簡(jiǎn)單的攪拌快速收獲，從而直接實(shí)現(xiàn)生物功能。這將被證明對(duì)分子表征非常有益，因?yàn)榉肿颖碚魍ǔＰ枰悦笧槊浇閷?duì)周圍基質(zhì)進(jìn)行侵入性溶解。同樣，低屈服應(yīng)力和自愈合特性為注射器擠壓提供了一種方法，分層材料的流化可保護(hù)細(xì)胞免受剪切力的影響，從而應(yīng)用于細(xì)胞輸送和生物制造?？紤]到這些水凝膠對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞同時(shí)具有殺菌和生物活性，Trpzip 水凝膠在體外和體內(nèi)作為治療生物材料的應(yīng)用前景十分廣闊。
文獻(xiàn)鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-41907-1
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