單個(gè)細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行增殖以及重組最終構(gòu)成復(fù)雜且有組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)可以模擬特定器官的功能，被稱之為類器官。類器官的細(xì)胞來源可被大致分為兩類，原代組織和多功能干細(xì)胞分化。盡管每個(gè)組織的類器官的形成過程會存在差異，但是類器官的大體形成過程遵循以下流程，增殖、分化、細(xì)胞分選、譜系定型和形態(tài)發(fā)生，形成3D類器官結(jié)構(gòu)[1,2]。
在類器官的培養(yǎng)過程中，細(xì)胞往往需要在培養(yǎng)基中進(jìn)行不受抑制的增殖，而這種不受抑制的增殖可以在低黏附的培養(yǎng)環(huán)境或生物材料中實(shí)現(xiàn)。生物材料可以模擬組織中天然的細(xì)胞外基質(zhì)為細(xì)胞提供3D的培養(yǎng)環(huán)境；此外，生物材料還可以是多種不同的細(xì)胞外基質(zhì)和多種生物因子的混合，這種復(fù)合的環(huán)境有利于細(xì)胞的粘附和增殖，并且生物材料可以在類器官的形成過程中酶解和重塑[3,4]。
目前，常見的用于構(gòu)建類器官的生物材料有，脫細(xì)胞組織，天然高分子材料，合成肽材料（表1）。不同的生物材料有著不同的特性，比如脫細(xì)胞組織有著與宿主組織高度相似的細(xì)胞外基質(zhì)成分，合成高分子材料有著可控的良好的機(jī)械性能等；而這些不同的材料特性又會對細(xì)胞行為進(jìn)行調(diào)控，例如，脫細(xì)胞基質(zhì)材料有利于細(xì)胞的體外黏附，有序排列的高分子材料可以促進(jìn)人類肌腱干細(xì)胞的分化等[5,6]。
表1 用于構(gòu)建類器官的生物材料及其來源
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類別 |
材料來源 |
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脫細(xì)胞組織生物材料 |
豬肝組織，人肝組織，豬胃組織，豬小腸組織，豬腎臟組織，小鼠肉瘤（Engelbreth–Holm–Swarm基質(zhì)） |
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天然高分子生物材料 |
家蠶繭，透明質(zhì)酸，膠原蛋白，海藻酸鹽，膠原玻璃質(zhì)凝膠，管狀絲海綿，纖維蛋白-層粘連蛋白 |
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合成高分子生物材料 |
聚乙二醇及其衍生物，Amikagel，聚乙交酯類，聚左旋乳酸類 |
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合成肽生物材料 |
PeptiGel Alpha4，PeptiGel Alpha5 |
基于以上內(nèi)容，本文從構(gòu)建類器官的生物材料角度切入，整理不同生物材料在類器官構(gòu)建方向的應(yīng)用供大家參考學(xué)習(xí)！本期內(nèi)容主要分為兩部分，一是重溫類器官相關(guān)的經(jīng)典綜述，二是結(jié)合本期主題為大家?guī)硐鄳?yīng)的代表性文獻(xiàn)。
一、代表性文獻(xiàn)綜述回顧
文獻(xiàn)1 Nature Reviews Methods Primers (IF 39.5 )：類器官
主要內(nèi)容：類器官是基于細(xì)胞的組織工程體外模型，再現(xiàn)了相應(yīng)體內(nèi)組織的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能的許多方面。目前已經(jīng)報(bào)道了許多支持類器官培養(yǎng)和生長、增殖、分化和成熟的類器官工程策略。為此，本文強(qiáng)調(diào)了選擇和發(fā)展這些材料的基本原理和控制細(xì)胞/組織生態(tài)位的方法。該綜述還介紹了成功構(gòu)建類器官的關(guān)鍵因素，例如種子細(xì)胞的分離和接種、基質(zhì)和可溶性因子選擇、物理因素和整合相關(guān)的因素；作者還介紹了關(guān)于類器官的數(shù)據(jù)質(zhì)量、重現(xiàn)性的一般標(biāo)準(zhǔn)。最后，作者詳細(xì)闡述了類器官在不同應(yīng)用中的局限性，以及未來幾年類器官的關(guān)鍵優(yōu)先事項(xiàng)。
圖1 類器官的組成部分
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s43586-022-00174-y
文獻(xiàn)2 Nature Reviews Materials ( IF 83.5 )：工程類器官
主要內(nèi)容：在傳統(tǒng)類器官培養(yǎng)過程中的存在著許多局限性，而這些局限性可以將類器官的各個(gè)組分進(jìn)行工程化來解決。因此，本文詳細(xì)介紹了通過細(xì)胞表面和基因工程方法構(gòu)建工程類器官，并討論了基于時(shí)間和空間控制的矩陣設(shè)計(jì)對于干細(xì)胞生態(tài)位的影響。同時(shí)，本文總結(jié)了通過微流控技術(shù)和器官芯片技術(shù)構(gòu)建類器官的經(jīng)驗(yàn)，展望了如何通過整合這些機(jī)械生理參數(shù)增加類器官構(gòu)建的可重復(fù)性。
圖2 組織來源的類器官
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41578-021-00279-y
文獻(xiàn)3 Annual Review of Neuroscience ( IF 13.9 )：腦部類器官研究中的挑戰(zhàn)
主要內(nèi)容：類器官可模擬正常或病理發(fā)育特征的腦組織，可作為探索人類大腦發(fā)育的工具。本文介紹了多功能干細(xì)胞（PSC）衍生的神經(jīng)培養(yǎng)物，以及相關(guān)的復(fù)雜的神經(jīng)類器官，這些類器官為揭示人類大腦發(fā)育的特征和探索大腦發(fā)育與人類疾病的相關(guān)性提供了一個(gè)極好的平臺。此外，本文認(rèn)為類器官模型在功能和疾病表型研究中有一定的局限性，例如在高度特定的細(xì)胞類型、功能回路的形成和活動、以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)駐留神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞類型之間相互作用的研究中。
圖3 大腦類器官的特點(diǎn)
原文鏈接：https://doi.org/10.1146/annurev-neuro-111020-090812
文獻(xiàn)4 Hepatology ( IF 13.5 )：類器官和再生肝病學(xué)
主要內(nèi)容：本文探討了3D類器官培養(yǎng)的發(fā)展進(jìn)程，類器官將如何應(yīng)用于肝膽系統(tǒng)，以及類器官技術(shù)如何與全球新興的肝臟再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相交叉。本文還總結(jié)了可用于類器官培養(yǎng)的肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)類器官系統(tǒng)，并討論了它們對于再生醫(yī)學(xué)的優(yōu)點(diǎn)和局限性以及未來的方向。
圖4 肝病再生醫(yī)學(xué)
原文鏈接：https://doi.org/10.1002/hep.32583
文獻(xiàn)5 Nature Materials ( IF 41.2 )：下一代腫瘤類器官
主要內(nèi)容：本文重點(diǎn)介紹了下一代癌癥類器官標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)得新方法，并展望了如何可重復(fù)且準(zhǔn)確地構(gòu)建腫瘤異質(zhì)性類器官。此外，本文認(rèn)為對于構(gòu)建腫瘤類器官的改善需要臨床醫(yī)生、生物學(xué)家和工程師的跨學(xué)科努力。成熟的腫瘤類器官將會重塑個(gè)性化治療的方式，并加速臨床治療的轉(zhuǎn)化，從而極大地改善患者的治療效果。
圖5 下一代腫瘤類器官
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41563-021-01057-5
二、代表性研究文章回顧
文獻(xiàn)6 Biomaterials (IF 14.0)：脫細(xì)胞肝組織來源的水凝膠用于膽管細(xì)胞類器官的生長和分化
材料：豬肝組織，人肝組織，Matrigel
方法：分別將離體豬/人肝組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理，隨后進(jìn)行冷凍干燥處理。用胃蛋白酶對組織進(jìn)行酶解，隨后將體系pH調(diào)節(jié)至中性/弱酸性得到預(yù)交聯(lián)溶液。將預(yù)交聯(lián)溶液置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育30-45分鐘可得到豬（PLECM）/人（HLECM）脫細(xì)胞肝組織來源的水凝膠。對肝組織中的細(xì)胞進(jìn)行分離，后將這些細(xì)胞先于基底膜基質(zhì)（BME）培養(yǎng)兩代后轉(zhuǎn)移至PLECM/HLECM繼續(xù)培養(yǎng)，隨后對其進(jìn)行類器官評估的相關(guān)考察。
結(jié)果：PLECM/HLECM水凝膠可支持膽管細(xì)胞類器官的增殖并維持膽管細(xì)胞樣表型；PLECM/HLECM水凝膠不會改變目的蛋白或基因的表達(dá)，例如膽管細(xì)胞標(biāo)記物（細(xì)胞角蛋白-7），并且在PLECM和HLECM水凝膠之間并未發(fā)現(xiàn)由種屬差異來帶的不同結(jié)果。
圖6 PLECM/HLECM水凝膠的制備過程及相關(guān)考察
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2022.121473
文獻(xiàn)7 Nature Communications (IF 16.6)：來源于組織細(xì)胞外基質(zhì)的水凝膠作為基質(zhì)膠的替代品用于胃腸道類器官的培養(yǎng)
材料：豬胃/小腸組織，Matrigel
方法：通過曲拉通X-100對胃/小腸組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理，得到脫細(xì)胞胃源性細(xì)胞外基質(zhì)（SEM）和脫細(xì)胞小腸源性細(xì)胞外基質(zhì)（IEM）。通過胃蛋白酶酸性溶液的處理得到預(yù)交聯(lián)的SEM/ IEM溶液，將該溶液與磷酸鹽緩沖溶液混合后調(diào)節(jié)pH至中性，通過溫度誘導(dǎo)的自組裝行為得到SEM/IEM水凝膠。從6-8周雄性C57BL/6小鼠的胃/小腸中分離腺體/隱窩，并在SEM/IEM水凝膠中進(jìn)行培養(yǎng)，隨后對其進(jìn)行類器官評估的相關(guān)考察。
結(jié)果：在胃腸道類器官的增殖和功能化中，SEM/IEM水凝膠展現(xiàn)類似于Matrigel的性能，并在大部分情況下下展現(xiàn)出優(yōu)于Matrigel的性能。此外，SEM/IEM水凝膠通過提供胃腸道組織模擬微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)了類器官的長期傳代培養(yǎng)和移植。通過蛋白組學(xué)分析闡明了組織特異性和年齡相關(guān)的細(xì)胞外基質(zhì)對于類器官發(fā)育的影響。
圖7 SEM/ IEM水凝膠的制備過程及相關(guān)考察
原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-29279-4
文獻(xiàn)8 Advanced Science (IF 17.521)：腎臟脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)材料用于增強(qiáng)人腎臟類器官的血管化和成熟
材料：豬腎臟，Matrigel
方法：將新鮮的豬腎臟組織去除腎包膜，腎周脂肪，腎內(nèi)脂肪和腎髓質(zhì)，將剩余的皮質(zhì)組織進(jìn)行冷凍切片處理，隨后將切片進(jìn)行脫細(xì)胞處理。將脫細(xì)胞后的組織進(jìn)行冷凍干燥處理，隨后對于進(jìn)行酸處理酶解，得到預(yù)交聯(lián)腎臟脫細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)溶液（dECM）。用預(yù)交聯(lián)溶液對24孔板進(jìn)行包被，并將人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（hPSC）進(jìn)行鋪板，隨后將Matrigel進(jìn)行鋪板，制備“三明治”類器官培養(yǎng)體系，隨后對其進(jìn)行類器官評估的相關(guān)考察。
結(jié)果：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)顯示，與未使用腎臟dECM培養(yǎng)的血管化腎臟類器官相比，使用腎臟dECM培養(yǎng)的血管化腎臟類器官具有更成熟的腎小球發(fā)育，并且與人類腎臟具有更高的相似性。通過使用腎臟dECM的培養(yǎng)方法，使用CRISPR/Cas9敲除由hPSC分化得到的腎類器官中的β-半乳糖苷酶A (GLA)，可有效重現(xiàn)法布里腎病伴血管病變。將腎dECM培養(yǎng)的腎類器官移植到小鼠腎臟中，可加速從宿主腎臟招募內(nèi)皮細(xì)胞；相比于沒有腎 dECM培養(yǎng)的腎類器官，該體系可通過組織的裂隙隔膜樣結(jié)構(gòu)來維持血管完整性。該腎臟dECM培養(yǎng)體系可用于誘導(dǎo)腎臟類器官廣泛血管化，研究腎臟發(fā)育、疾病建模和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
圖8 腎臟dECM的制備過程及相關(guān)考察
原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202103526
文獻(xiàn)9 Advanced Healthcare Materials (IF 10.0)：使用低濃度膠原蛋白生物墨水對乳腺腫瘤細(xì)胞和類器官進(jìn)行嵌入式生物打印
材料：家蠶繭，胺封端的聚（N-異丙基丙烯酰胺，pNIPAM），透明質(zhì)酸（HA），4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)−4-甲基氯化嗎啉（DMTMM），I型牛膠原蛋白
方法：通過煮沸透析消化等處理得家蠶繭溶液（SF）。將pNIPAM通過偶聯(lián)劑DMTMM修飾在HA的骨架上得到HA–pNIPAM。將I型牛膠原蛋白通過1N氫氧化鈉溶液中和后得到膠原蛋白前體溶液（collagen），將HA–pNIPAM與collagen共孵育得到collagen–HA–pNIPAM (CH) 前體溶液，隨后在37℃下對CH前體溶液進(jìn)行聚合得到CH水凝膠。從12周C3小鼠的腫瘤組織中分離相關(guān)細(xì)胞，并將細(xì)胞與CH前體溶液混合，在SF通過生物打印得到相關(guān)腫瘤類器官，并對其進(jìn)行相關(guān)評價(jià)。
結(jié)果：在SF水凝膠浴的支持下，可以對低粘度I型膠原進(jìn)行高形狀保真度的生物打印；并且在I型膠原蛋白生物墨水中添加HA-pNIPAM可保持不同亞型乳腺癌細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的原始表型。這種生物打印體系進(jìn)一步驗(yàn)證了高通量制造腫瘤類器官模型的優(yōu)勢，該體系成功復(fù)制了體內(nèi)腫瘤形態(tài)和細(xì)胞表型。此外，通過簡單地調(diào)整基于膠原蛋白的生物墨水成分和打印圖案，可以制造具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和至少三種類型細(xì)胞的器官模型。
圖9 CH類器官的構(gòu)建和相關(guān)評價(jià)
原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adhm.202300905
文獻(xiàn)10 Bioactive Materials (IF 16.8)：全合成肽水凝膠用于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (hiPSC)的生長和分化構(gòu)建衍生腎類器官
材料：自組裝肽（PeptiGel Alpha4，PeptiGel Alpha5）
方法：通過PeptiGel Alpha4構(gòu)建低剛性水凝膠（Alpha4），PeptiGel Alpha5構(gòu)建高剛性水凝膠（Alpha5），用于培養(yǎng)腎類器官。并對Alpha4和Alpha5腎類器官的流變、溶脹、形貌、分化情況、活力、增殖等進(jìn)行考察。
結(jié)果：自組裝肽水凝膠(SAPH)作為3D仿生環(huán)境，可用于hiPSC衍生的腎臟類器官的構(gòu)建。由SAPH內(nèi)培養(yǎng)的功能性腎細(xì)胞類型，可知SAPH足以用于腎類器官培養(yǎng)，從而不需要復(fù)雜的、定義不明確的動物源性基質(zhì)（例如基質(zhì)膠）。通過scRNAseq，SAPH還揭示了體外生長環(huán)境對產(chǎn)生組成不同的細(xì)胞類型和擾亂細(xì)胞命運(yùn)的影響。與較軟的Alpha4相比，較硬的Alpha5生成的類器官中含有更多成熟足細(xì)胞并且腎單位細(xì)胞類型比例增加。與在氣液界面生長的腎臟類器官相比，在3D基質(zhì)內(nèi)生成的類器官具有更少的脫靶細(xì)胞類型，這說明了生物物理環(huán)境對細(xì)胞行為的調(diào)控。
圖10 SAPH內(nèi)形成的 hiPSC衍生腎類器官的分化方案和后續(xù)表征
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2022.08.003
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