本文以氣相色譜開發(fā)為索引進行簡單的小結和擴展，本著個人經(jīng)驗與判斷進行敘述。文章簡單進行如下區(qū)塊劃分：其一，近些年實驗過程中所遇到的小BUG分享；其二，氣相色譜/質譜分析方法常規(guī)流程分享。
有著自己“小脾氣”的分析儀器
每臺機器都有著屬于自己的“脾氣”，長期從事分析行業(yè)的老師們可能或多或少的都有感覺“分析儀器會認主?。?！”，有時候用自己的儀器用的萬分順手，奈何在進行中間精密度實驗的時候總有需要更換同型號儀器實驗的情況，一旦更換儀器就得萬分小心。。。（忽如一夜秋分來，偏差領到手抽筋。。。）因為壓根不知道會出現(xiàn)哪些小bug~~~（下文所列出的BUG希望各位分析人永遠都不要遇到~阿彌陀福~BUG退散~~~）
雖然目前氣相/液相等分析都在做，但究其出身來看本人還是屬于氣相背景的，自大學伊始就在環(huán)境評測實驗室進行學術研究，正因如此初到公司所管理的儀器便是氣相+氣質，當時年少無知…一看到自己所管理的儀器那叫一個意氣風發(fā)啊~不就簡單的GC嗎…學習期間都已經(jīng)摸得滾瓜爛熟了，絲毫沒有挑戰(zhàn)性?。ㄉ畹拇蟀粼蚁聛淼奶欤。┯捎诠ぷ靼才诺仍颍肼殐芍鼙汩_始獨立進行分析并兼任儀器的維護、核查，可能是儀器欺生？自己剛開始獨立上崗各種儀器BUG就找上門來了…
一、儀器報錯“External device not ready”
“External device not ready”這個報錯…我能說到現(xiàn)在都還沒能完全解決嗎？期間也約了安捷倫工程師遠程+現(xiàn)場排查（硬件、應用、軟件工程師輪番上陣）愣是沒能把這個報錯給消除掉…雖然有辦法正常進樣…但就是每次看著亮著黃燈（報NOT READY）的儀器心里發(fā)堵 （心里難受卻又不知道如何表述）
▲圖1-8890 GC端報錯顯示
▲圖2-7697A 頂空進樣器端儀器顯示
這個報錯在儀器硬件固件版本升級后就一直出現(xiàn)（軟件控制采用Mass Hunter），當初工程師上門升級固件后儀器正常運轉也沒在意，到第二天序列跑完后就發(fā)現(xiàn)儀器無法READY，隨即聯(lián)系硬件工程師上門排查未能發(fā)現(xiàn)原因，后續(xù)經(jīng)過多輪測試暫且摸尋出“External device not ready”的報錯會在氣相色譜&頂空進樣器端均進行重啟后消失，儀器均可READY（質譜7010端可以不進行重啟）。
但在進行進樣操作后（不論是單針進樣運行方法還是序列進樣），儀器隨即無法進入READY狀態(tài)，一直報錯“NOT READY：External device not ready”，這個報錯狀態(tài)已經(jīng)影響到儀器的正常使用，不可能每次進樣前都對頂空進樣器和GC端進行重啟！
也考慮到其報錯是外部設備未就緒，我司聯(lián)合安捷倫軟、硬件工程師多次對頂空設備和直接進樣器進行排查（期間甚至換過一個直接進樣塔并對頂空的固件進行了升級），發(fā)現(xiàn)直接進樣的儀器方法需對GC端進行重啟，頂空進樣的方法需對頂空+GC端進行重啟后，此報錯才能消失。
后續(xù)跟安捷倫工程師協(xié)商后再度對軟件版本進行升級此報錯亦是無法消除，但儀器可以正常使用了！經(jīng)測試，僅報錯“External device not ready”狀態(tài)下儀器能夠正常進樣，無干擾！
（上述情形如各位同仁有所涉獵亦是歡迎交流?。?/span>
二、7010質譜調諧BUG
7010質譜調諧過程報錯“2.5放射電流控制器無法在指定的時間之后調節(jié)請求的設置”，這個報錯之前一直存在！維護這臺儀器的前輩均是當作離子源燈絲燒斷來處理的，而且就往常經(jīng)驗來看…也確實切換燈絲就能夠實現(xiàn)正常調諧！燈絲燒斷，切換燈絲！皆大歡喜！
▲圖3-7010質譜調諧過程報錯
奈何就是出現(xiàn)了我這種不走尋常路的人…在某次GMP項目之前，處于對實驗項目負責的態(tài)度（Ps.以防意外發(fā)生產(chǎn)生偏差…小命要緊），本人對儀器進行了“術前”…不對…進樣前的最終確認和維護！
儀器出現(xiàn)上述報錯…我并未進行燈絲切換，而是對離子源進行拆卸維護！?。。ú蛔邔こＢ?nbsp; nice~）
▲圖4-f7010質譜離子源
這不拆不知道~一拆嚇一跳…圖4中離子源狀態(tài)距離上次清洗僅一周時間…可見期間分析的中藥樣品是多么的emmm…，清洗完干干凈凈的離子源重新裝機，陰差陽錯之下…不知道為何就是想更換一個新的燈絲試一試儀器情況（說白了就是GMP項目想用新燈絲了…自己找了個說服自己的借口 ）。
▲圖5-7010 新燈絲裝機紀念
新燈絲上機后經(jīng)過一番祈禱后（可能是有用了?。╅_始進行調諧，好么~~~報錯依舊未消失。
▲圖6-報錯依舊
“2.5放射電流控制器無法在指定的時間之后調節(jié)請求的設置”儀器故障…儀器故障已清除…1號燈絲依舊無法使用，只能切換2號燈絲使用，這可是新?lián)Q的燈絲?。。?！好幾千大洋呢！??！得…還是GMP放行要緊先讓儀器穩(wěn)定好等后續(xù)有空在進行研究。
這一耽擱…又是過去了數(shù)周，等我回想起來的時候切換燈絲1又能夠正常使用了?。。『罄m(xù)檢測過程中也時有發(fā)生，聯(lián)系安捷倫售后也無法解決這個問題，我們本著穩(wěn)定使用的原則，每當出現(xiàn)這個問題就進行切換燈絲的操作，這個BUG也成為了一個未解之謎 。
三、儀器被未知用戶占用
7697A-8890-7010在進行頂空進樣的時候出現(xiàn)被踢下線的情況，要知道這臺設備是通過Mass Hunter單機軟件進行控制的，無第二組信號源接入，且頂空進樣器已經(jīng)完成1號樣品瓶進樣，GC-MS端正在進行樣品數(shù)據(jù)的采集，具體報錯如下圖7中所示。
▲圖7-系統(tǒng)提示HS被另外電腦占用
圖7中可以看到警告提示HS在監(jiān)控模式被另外電腦占用，可是本臺儀器有且僅有這一個MassHunter 控制端，并且此提示過程中可以看到左上角的儀器狀態(tài)部分，GC和MS均處于脫機狀態(tài)！正常進樣第一針…第二針進入頂空瓶預熱過程中隨機出現(xiàn)儀器脫機情況…
隨即重啟軟件并檢查儀器端顯示情況，如下圖8.
▲圖8-系統(tǒng)提示HS被另外電腦占用
上圖是8890端液晶顯示器的部分，可以看出Col1和Col2兩個色譜流路均被占用，Col2流路所加載的應該是軟件重啟后所帶的FID方法，此FID方法是用于上次檢測的用途，而本次所使用的頂空方法為Col1中的MS方法。也就是說儀器被異常占用后儀器默認當前方法失效從而調取的上次進樣方法來進行加載，從而儀器硬件所得到的download模式就變成了雙色譜柱進樣模式？?。ㄖ坝新犙壕凭珳y試的同事說過這種類似的雙色譜進樣？有熟悉的老師可以幫忙科普一下?。?/span>
解決方案：對所屬儀器進行完全性斷電重啟即可。
在故障排查過程中也嘗試過重啟軟件和重啟硬件，軟件重啟后脫機狀態(tài)消失但是依然無法正常加載方法，可對儀器進行放空操作！儀器放空后無法正常抽真空?。?！多次進行抽真空操作均會造成軟件脫機，隨后嘗試進行GC端和HS端的重啟操作無法解決問題，MS端也進行短時間斷電重啟操作，問題依舊無法解決，最終對儀器進行完全的斷電，靜止半天后于當天下班前重啟成功！儀器恢復正常連接。
此故障自本人接觸分析儀器數(shù)十年以來第一次遇見！已經(jīng)向安捷倫售后報備，暫無進一步反饋！
四、其余故障
▲圖9-PE的HS-40進樣器維護報警
PE的40位頂空在日常研究過程中亦是常有用到其經(jīng)常性的會出現(xiàn)維護報警（嚴重的時候一個序列報警一次，對進樣次數(shù)進行重置后亦未能消除），經(jīng)過排查并非儀器進樣次數(shù)限度設置問題（儀器中有一個進樣次數(shù)的計數(shù)器，正常來說進樣一定次數(shù)后便會警告提示需要對頂空進樣器進行系統(tǒng)維護），后聯(lián)系PE官方從南京派遣來了一位應用工程師進行進樣器的系統(tǒng)維護后問題未再次發(fā)生。
▲圖10-CTC進樣器白屏
上述是一臺外掛在7890B氣相色譜上的瑞士CTC進樣器，此進樣器由于能夠兼容直接進樣和頂空進樣兩種形式從而被廣大研究人員所青睞，本次故障是在正常進樣過程中進樣器液晶遙控器出現(xiàn)白屏現(xiàn)象，遙控器上4個按鍵均“失靈”索性由于儀器方法已經(jīng)download完成，并未對此次進樣序列產(chǎn)生干擾。通過斷電重啟完成故障排除。
五、儀器BUG小結
在我們日常分析檢測過程中或多或少會遇到一些儀器使用問題，只要對儀器精心維護，總體來說具有經(jīng)驗的“老法師”們往往也都能夠很好的排除掉。（Ps.重啟大法雖然好~但是不要隨便亂用喔！尤其是冬天重啟過程中可能會出現(xiàn)靜電電涌，對儀器的電路板造成擊穿?。。。﹤€人小結幾點儀器容易出現(xiàn)BUG的節(jié)點，供各位“法師”們參考！
1、自己管理的儀器借給他人使用的時候，尤其是借給他人進行方法開發(fā)時，不是別人使用出現(xiàn)BUG就是儀器換回來的時候使用不順手！
（一般公司不會奢侈到人手一臺儀器吧？普通氣相液相還好說，三重四級桿質譜和高分辨質譜啥的不可能人手一臺的吧？！所以同事間相互占用是很正常的事情?。?/span>
解決方案：注重儀器管理人員的培養(yǎng)并強調儀器管理人員和品牌方工程師之間需要緊密溝通，倘若儀器有購買年度維保計劃，那就多多的加強和維保工程師的聯(lián)系，從每次維保過程中充分發(fā)揮培訓作用，有效的將分析應用人員向綜合儀器工程師轉化，至少保證公司內有一位熟悉儀器硬件的人員，從而更好的排查儀器BUG，保障儀器的正常運轉。
2、未連接UPS電源的儀器長期關機時請將插座拔下，尤其是部分高校實驗室的應用場景，市政供電電路未能充分考慮供電穩(wěn)定性，而UPS電源能夠有效充當穩(wěn)壓穩(wěn)流的作用，以免突然斷電或者長期斷電后儀器重啟時產(chǎn)生不穩(wěn)定電流對儀器造成損壞。
3、在進行部分痕量物質分析過程中，需要充分對儀器進樣器、隔墊、傳輸管線、進樣針的限位器等等進行全面清洗和維護，以免在開發(fā)過程中所完善的方法，再進行驗證時出現(xiàn)未知原因的干擾，如在開發(fā)過程中能夠穩(wěn)定出峰的目標物實際為外界干擾所物。之前出現(xiàn)過進行環(huán)境外源性污染物的殘留測定過程中一直有基質干擾，最終排查下來發(fā)現(xiàn)是由于進樣針限位器末端殘留所引入干擾的情況。氣相色譜的開發(fā)有時候就跟程序員開發(fā)的程序類似，開發(fā)過程一切OK，一旦驗證過程中發(fā)現(xiàn)來BUG并且又想去修復他…這時候…雪崩就開始了，一旦修復其中某一BUG就會產(chǎn)生連帶效應，從而造成全盤推翻前期開發(fā)的所有工作的情形！
并且氣相色譜的開發(fā)過程中經(jīng)常性的會發(fā)生各種人機不合的小bug，儀器正常運行的話大家一直相安無事好幾年~但是…有可能就是儀器換人使用的這一次…一旦出現(xiàn)問題就會產(chǎn)生無從排查的尷尬境地。只能一點點的從進樣口開始排查，也往往進樣口發(fā)現(xiàn)問題最多！安捷倫工程師統(tǒng)計故障來看，氣相色譜所出現(xiàn)的所有應用BUG中，90%都是由于進樣口的問題所造成的！
氣相色譜/質譜分析方法流程知多少？
話不多說，先上干貨！
▲圖11-GC/GCMS方法開發(fā)流程圖
（上述流程僅為自身經(jīng)驗小結，僅供各位小伙伴參考使用，并不保證普適性）
隨著現(xiàn)代精細化工的不斷發(fā)展，氣相色譜法在日常分析中越來越被受重視。對于一個新產(chǎn)品來說其質控檢驗是非常重要的。下面將簡單小結一下日常GC/GCMS分析方法開發(fā)過程。
通常分析方法的開發(fā)分三步走~
1、供試品、目標物及應用目的等信息確認；
2、檢測器及色譜柱篩查及選擇；
3、方法預驗證及正式驗證。
供試品、目標物及應用目的等信息確認：
首先我們分析人員接手項目時要與技術支持部門的同事（部分扁平化管理的公司可能會出現(xiàn)技術人員直接跟銷售人員對接客戶需求的情況）確認好本次GC分析方法開發(fā)用途及目的?。?！
我們需要精益求精！但現(xiàn)實告訴我們社會中…人無完人??！
就像2015版藥典發(fā)布之前各個藥廠的申報資料中對于新型目標物含量測定均遵循CDE含量測定公告的統(tǒng)一原則，不論目標物在供試品中的占比多寡~均要求其精密度RSD達到2%以內，準確度達到98%~102%一樣…甚至可以要求更高！
越高的要求~對儀器的維護要求更高，對于儀器的專一性將會提出更為嚴格的要求！因此對于用戶目的一定要明確?。。⒁越桓赌康牡姆椒ㄩ_發(fā)驗證和以研究為目的的方法開發(fā)區(qū)分開來，從而才能更好的做到高效、專注！
再者，確認樣品的狀態(tài)：中控反應液；樣品純度；溶殘種類以及樣品穩(wěn)定性！
最后，確認目標物的理化性質，溶解性和穩(wěn)定性等；一般適合使用氣相分析方法檢測的目標物：其是可揮發(fā)、熱穩(wěn)定性好、分子量通常小于500、沸點一般不超過300℃、在液相中幾乎無響應、大部分含有四元環(huán)、五元環(huán)和六元環(huán)結構、部分橋環(huán)螺環(huán)結構等。（注意：當化合物為鹽酸鹽時需要進行游離后進樣。）
檢測器及色譜柱篩查及選擇
檢測器選擇：
▲圖12-檢測器性能示意圖（圖片摘至安捷倫大學培訓教材，侵刪！）
通常開發(fā)過程中是需要根據(jù)目標物進而匹配適宜的檢測器，當然MS可測萬物~~~，部分客戶為了匹配自身儀器情況且節(jié)約后續(xù)轉移成本會要求開發(fā)盡可能避免MS方法，轉而要求開發(fā)適宜的GC方法！
檢測器選擇不僅要看檢測器限度（圖12），而且要看檢測器性能匹配度！如圖12中所示，ECD檢測器的限度能夠達到fg級別甚至一度低于MS檢測器，但是其由于工作原理等特性（下期文章簡單介紹一下GC的各種檢測器工作原理?。┮灾劣贓CD的普適性不廣！其中NPD檢測器亦是如此，其由于銣珠的特殊情況，僅支持N、P的檢測。
色譜柱的選擇：
通常實驗室中供給氣相色譜所用的載氣以氮氣為主，少見有氦氣作為載氣的，原因也很簡單，目前氦氣的供氣價格（50L鋼瓶氣）是氮氣的30倍以上?。?！
一般而言只有三重四級桿的氣相系統(tǒng)采用氦氣做載氣（安捷倫碰撞氣為氮氣、島津為氬氣），因此在方法開發(fā)過程中不同于液相進行流動相更換，氣相色譜開發(fā)很少會改動載氣類型，所以GC方法開發(fā)核心在色譜柱篩選上，色譜柱篩選思路如下：
固定相的選擇：如果不確定要使用的哪種固定相，可從DB-1 或DB-5 開始。
內徑：高柱效的色譜柱，請使用0.18-0.25 mm 內徑的色譜柱；如果需要較大的樣品容量，請使用0.32 mm 內徑的色譜柱；大口徑直接進樣器時，才使用0.53 mm 內徑的色譜柱。特別適用于高載氣流速的情況，例如吹掃捕集、頂空進樣器0.53 mm 內徑色譜柱在恒定的液膜情況下具有最高的樣品容量。
柱長的選擇：如果不知道最佳長度，請使用25-30 米長的色譜柱。主要看分離度。
膜厚的選擇：厚液膜色譜柱用于保留和分離揮發(fā)性溶質。厚液膜色譜柱惰性更強，容量更大。厚液膜色譜柱具有較高柱流失性，使用溫度上限也有所降低。薄液膜色譜柱用于將高沸點高分子量溶質，薄液膜色譜柱惰性較弱，容量較小。薄液膜色譜柱的氣密性較好。
初始分離條件：低于溶劑沸點20°C的起始溫度，10°C/min升至色譜柱耐受溫度以下20°C，保持10min。
色譜柱篩選過程中關鍵判定因素：
1.峰形
判斷標準：峰型良好，沒有嚴重的峰前伸和峰拖尾現(xiàn)象；
（藥典標準拖尾因子在0.95~1.05之間，通常方法開發(fā)過程中如未預見干擾峰對峰形的判定可適當放松）。
出現(xiàn)嚴重的峰拖尾現(xiàn)象怎么辦？
首先，檢查儀器的進樣系統(tǒng)有沒有污染的可能性；（如：隔墊、襯管等，是在沒轍也可以檢查一下分流平板，金墊一般建議2年左右更換一次，也遇到過實驗室儀器壽命內未更換依舊正常進樣的情況）
其次，確認色譜柱裝載是否正確！新手請帶教老師確認色譜柱切割的是否平整！不同品牌的儀器螺母扭矩需確認以避免色譜柱端的泄漏情況；（先用手擰緊柱帽，再用扳手擰緊。安捷倫：大拇指輕微用力，帶不動為宜，此刻扭矩合適；島津：扳手擰緊后回1/4圈為宜。）
若峰拖尾現(xiàn)象仍無明顯改善，選擇更換色譜柱柱效較好的色譜柱；若更換后峰拖尾現(xiàn)象無明顯改善，嘗試其他不同類型色譜柱；（色譜柱極性需區(qū)分清楚，針對不同的物質使用不同極性的色譜柱，理論來說適宜的前提下色譜柱極性越大目標物分離效果越好?。?/span>
1、柱長越長，分離效果越好
2、內徑越小，保留能力越強
3、膜厚越厚，保留能力越強
（如后續(xù)有需要可更新GC/LC色譜柱選擇的文章?。?/span>
出現(xiàn)嚴重的峰前伸現(xiàn)象怎么辦？
首先確認是否為色譜柱過載，調整進樣量或者以新開封的標準品重新配制新的溶液進行測試；
也可以嘗試適當增加分流比。
不同溶劑的變化亦是對峰形有著致命的影響（圖13），因此在進行色譜柱選擇的過程中需要充分了解目標物和供試品的理化特性?。?！
▲圖13-100ng/ml的硫酸二甲酯在不同溶劑中的響應（色譜柱：HP-5MSUI）
2.分離度
當分離度（R）＞1.5時，滿足檢測要求。
當分離度（R）＜1.5時，嘗試在原有體系里調整梯度進行分離。
若嘗試調整梯度，R ＜1.5，考慮換其他類型色譜柱和檢測方法。
3.保留時間
RT：一般是指數(shù)據(jù)采集伊始為0min，目標組分色譜峰定點所標示的時間位點為該組分的保留時間。
氣體流速異常（檢查EPC控制器）、升溫程序異常（校準OVEN）、色譜柱污染（適當切割色譜柱柱頭）、分流/放空管路異常（檢查管路是否泄漏堵塞或者電磁閥故障）、色譜柱異常（檢查柱效、規(guī)格和老化情況等）
方法預驗證及正式驗證
根據(jù)《中國藥典》2020年版9101：分析方法指導原則（圖14）可知，一套完整的定量分析方法驗證需要完成系統(tǒng)適應性、專屬性、線性及范圍、檢出限、定量限、精密度（重復性和中間精密度）、準確度、耐用性、溶液穩(wěn)定性等參數(shù)的測試。
在常規(guī)方法學開發(fā)過程中為了保證方法的重現(xiàn)性以及普適性，往往會通過預驗證對方法進行最終檢查，完整的預驗證通過后方可進行正式驗證，正式驗證中的中間精密度測試（人員、儀器、時間三個參數(shù)選擇兩組參數(shù)進行更換后再測試）則是對現(xiàn)開發(fā)的方法最終復核?。?！通過多道措施保障方法的準確性！
▲圖14-9101：分析方法指導原則檢驗項目&驗證指標（摘自中國藥典2020版四部）
進樣口溫度：對準確度（回收率）的影響因素
▲圖15-A:甲磺酸甲酯，沸點210; B:甲磺酸乙酯，沸點220; C:甲磺酸異丙酯，沸點230
實際開發(fā)過程中常常接觸到磺酸酯類物質，其沸點均高于200℃，常規(guī)方法我們是否對進樣口溫度設定均會高于250℃？但實際研究表明，進樣口溫度設定在300℃時，上述三種磺酸酯類物質在沙坦類供試品中的回收率高達130%~200%，在眾多排查無果后我們嘗試對進樣口溫度進行降低處理，當進樣口溫度降低到150℃時，目標物回收率達到96%~115%，其準確度達到可接受標準。（磺酸酯類的衍生終止劑推薦使用Vc可以很好的降低光干擾，從而有效提高準確度?。?/span>
添加劑：對準確度（回收率）的影響因素1
▲圖16-雜質研究1
對丙二腈雜質研究過程中發(fā)現(xiàn)，直接溶解后進樣無論如何都沒法提高其回收率（一直在30%~40%左右波動），一度準備放棄后進行限度驗證?。?！隨后抱著死馬當活馬醫(yī)的心態(tài)在其溶液體系中加入強酸0.5%甲酸（簡稱FA，下同）回收率瞬間飆升達到95%~102%，氣相分析偶爾會添加FA和氨水…但是其比例基本都在0.1%左右，0.5%的強酸環(huán)境對色譜柱也是極大的考驗！發(fā)現(xiàn)回收率OK后又進一步對色譜柱進行篩選，最終完成項目交付！
色譜柱小知識：
HP-5和DB-5均為5%的苯基，但鍵合在直鏈和支鏈上的比例不同
HP-5：弱酸性，適合中性和酸性化合物
DB-5：弱堿性，適合堿性化合物的分析
添加劑：對準確度（回收率）的影響因素2
▲圖17-雜質研究2
同樣的回收率問題亦是發(fā)生在N, N-二乙基苯胺的研究過程中，研究期間一度嘗試添加氨水以保證目標物的穩(wěn)定性！奈何回收率最多只能做到65%，整個團隊都對項目抱有悲觀的態(tài)度?。ó吘巩敃r手上項目多，也有很多退單的情況?。┮灰а酪欢迥_…上了1%濃度的氨水~~~回收率蹭的一下…又上去了！達到106%~115%，有驚無險的壓著項目周期交付！
添加劑：對溶解度的影響
▲圖18-雜質研究3
老法師們估計發(fā)現(xiàn)了！圖18中的排版發(fā)生了變化，樣品放到前面來了~硫酸二甲酯已經(jīng)是被充分研究過的目標物了~這次難溶的是供試品吉美嘧啶！在有機溶劑中的溶解性不是很好，因為是嘧啶的緣故嘗試采用濃氨水直接溶解，沒有問題，但是不太適合進樣…常規(guī)濃度0.1%~1.0%濃度氨水添加，溶解效果不是很好，且水溶液直接進樣對色譜柱有一定的風險。因此提高氨水濃度，更換稀釋劑種類，當50%甲醇:水作為稀釋劑，氨水濃度提高到7.0%時能夠充分溶解限度設計水平的目標物，回收率落定在95%~110%區(qū)間內！
最后，由衷的希望各位分析人項目交付能夠快速！高效！穩(wěn)定！
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