近日，廣東省醫(yī)療器械管理學(xué)會(huì)發(fā)布《重組膠原蛋白醫(yī)用敷料體外透皮吸收評(píng)價(jià)指南（征求意見(jiàn)稿）》，內(nèi)容如下：
重組膠原蛋白醫(yī)用敷料體外透皮吸收評(píng)價(jià)指南
1、 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了重組膠原蛋白醫(yī)用敷料透皮吸收試驗(yàn)方法的適用的范圍、術(shù)語(yǔ)和定義、試驗(yàn)原理、試驗(yàn)用受試物的要求、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)數(shù)據(jù)和報(bào)告。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于重組膠原蛋白醫(yī)用敷料用于非慢性創(chuàng)面時(shí)所含重組膠原蛋白透皮吸收的評(píng)價(jià)。標(biāo)準(zhǔn)適用的敷料類(lèi)型為創(chuàng)面敷貼、凝膠敷料、液體敷料、膏狀敷料。本標(biāo)準(zhǔn)并非適用于檢測(cè)所有的情況，僅適用于皮膚透皮的最初定性評(píng)價(jià)。在某些情況下，應(yīng)進(jìn)一步參考體內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
醫(yī)用敷料中常見(jiàn)的絲素蛋白、貽貝蛋白及其它蛋白類(lèi)可參考本標(biāo)準(zhǔn)，但需要根據(jù)具體的產(chǎn)品特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
2、 規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
GB/T 27818-2011《化學(xué)品皮膚吸收體外試驗(yàn)方法》
《皮膚外用化學(xué)仿制藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》
《中華人民共和國(guó)藥典》
3、 術(shù)語(yǔ)和定義
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。
3.1 離體皮膚組織
從人或動(dòng)物體表分離出的符合體外透皮吸收試驗(yàn)需要的皮膚組織，可直接用于試驗(yàn)，或經(jīng)過(guò)一定創(chuàng)面制備流程后用于體外透皮吸收試驗(yàn)。
3.2 創(chuàng)面
正常皮膚（組織）在外界致傷因子如外科手術(shù)、外力、熱、電流、化學(xué)物質(zhì)、低溫以及機(jī)體內(nèi)在因素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。常伴有皮膚完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失，同時(shí)，皮膚的正常功能受損。
3.3 受試物
重組膠原蛋白經(jīng)熒光標(biāo)記后，按終產(chǎn)品生產(chǎn)工藝制備成的重組膠原蛋白醫(yī)用敷料。
3.4 待測(cè)物
熒光標(biāo)記后的重組膠原蛋白。
3.5 終產(chǎn)品
經(jīng)受過(guò)所有加工過(guò)程處于“待上市”的醫(yī)療器械或醫(yī)療器械組件，其加工過(guò)程包括包裝以及滅菌（如適用）。
4、 試驗(yàn)原理
將重組膠原蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記后配置受試物，將離體豬皮制備創(chuàng)面后進(jìn)行體外透皮吸收試驗(yàn)，用熒光信號(hào)來(lái)定量、定性和追蹤重組膠原蛋白，從而評(píng)價(jià)重組膠原蛋白是否透過(guò)皮膚。
5、 受試物要求
5.1 熒光標(biāo)記
將熒光通過(guò)共價(jià)結(jié)合的方式標(biāo)記到重組膠原蛋白上，常用熒光標(biāo)記有Cy5、FITC、CyP等。
5.2 標(biāo)記率考察
應(yīng)提供標(biāo)記前后全波段吸收峰掃描圖和SDS-PAGE電泳，同時(shí)報(bào)告標(biāo)記產(chǎn)物的熒光標(biāo)記率。
5.3 受試物制備
應(yīng)提供采用標(biāo)記的重組膠原蛋白制備受試物的詳細(xì)過(guò)程。受試物的制備過(guò)程應(yīng)與終產(chǎn)品的工藝過(guò)程相同，如有不同，應(yīng)給出理由。
5.4 受試物穩(wěn)定性考察
應(yīng)在與試驗(yàn)條件相同條件下（溫度、濕度、光照程度等）考察受試物的熒光穩(wěn)定性，建議受試物穩(wěn)定性至少考察48 h。
6、 試驗(yàn)方法
6、1體外透皮吸收試驗(yàn)
6.1.1 擴(kuò)散池的選取
考慮到設(shè)備的可及性，建議選擇靜止式（Franz）擴(kuò)散池作為擴(kuò)散設(shè)備。
6.1.2 離體皮膚組織的選取
考慮到物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似性、創(chuàng)面制備的要求、以及對(duì)親水性分子來(lái)說(shuō)豬皮通透性高于人皮，離體皮膚組織選取1 ~ 2月齡巴馬豬背部或腹部皮膚，厚度1mm以下，新鮮離體皮膚組織或冷藏、冷凍后的離體皮膚組織使用前建議采用經(jīng)皮失水儀對(duì)皮膚的經(jīng)皮失水率進(jìn)行檢測(cè)，以便了解皮膚屏障功能的情況。
6.1.3 接收液
考慮到待測(cè)物重組膠原蛋白水溶性極好，推薦接收池的溶液為磷酸緩沖液、HBSS溶液等。溫度建議 設(shè)置為32 ℃±1 ℃。
6.1.4 上樣
a) 半固體、固體受試物:5 mg/cm²
b) 液體受試物：10 μL/cm²
c) 或依據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)使用量。
6.1.5 試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)
依據(jù)終產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)確定產(chǎn)品每日積累使用時(shí)長(zhǎng)，建議的試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)最低為每日積累使用時(shí)長(zhǎng)的2倍，最低試驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)不低于1h，也不宜超過(guò)24h。建議至少在試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)間取樣檢測(cè)，不限制期間取樣次數(shù)。
6.1.6 實(shí)驗(yàn)分組
為了去除豬皮本身的膠原蛋白帶來(lái)的誤差，設(shè)置空白對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組的受試物為與樣品組受試物配方相同，但不加入重組膠原蛋白的空白對(duì)照品。樣品組的受試物是重組膠原蛋白醫(yī)用敷料?？瞻讓?duì)照最少設(shè)置2個(gè)平行樣、樣品組最少設(shè)置4個(gè)平行樣。
6.1.7 裝置準(zhǔn)備
將配套的磁子放置于擴(kuò)散池的接收池內(nèi)，并將離體皮膚組織固定于供給池和接收池之間，固定后在接收池中加滿(mǎn)接收液。排盡空氣，使離體皮膚組織的底面與接收液緊密接觸。攪拌速率的選取以實(shí)現(xiàn)對(duì)接收池內(nèi)樣品進(jìn)行充分混勻但表面無(wú)渦旋為宜。
6.2 創(chuàng)面皮膚制備
應(yīng)使用合適的方法制備皮膚創(chuàng)面，不恰當(dāng)?shù)奶幚砜赡芡耆茐慕琴|(zhì)層，使離體皮膚組織無(wú)任何屏障功能。為了保證試驗(yàn)的順利進(jìn)行，創(chuàng)面的制備過(guò)程應(yīng)結(jié)合終產(chǎn)品的臨床用途，重點(diǎn)考慮角質(zhì)層的損傷程度，建議保留角質(zhì)層部分屏障功能；如有穿刺或切割傷，建議損傷僅達(dá)表皮層，不傷及真皮層。
角質(zhì)層完整的皮膚經(jīng)皮失水值為＜15 g/m²·h，考慮到經(jīng)皮失水值在不同部位的差異和加嚴(yán)情況，建議造模后創(chuàng)面經(jīng)皮失水值在20 g/m²·h以上。
推薦的創(chuàng)面皮膚制備方法有膠帶剝離法、微針穿刺法、砂紙擦傷法等。基于不同模型，不同受試物條件下，造模過(guò)程和透皮試驗(yàn)均受多種因素影響，創(chuàng)面制備方法不做具體規(guī)定，試驗(yàn)人員可參考相關(guān)文獻(xiàn)。
6.3 受試物檢測(cè)
6.3.1 定量檢測(cè)
試驗(yàn)的2個(gè)空白對(duì)照平行樣和至少3個(gè)樣品組平行樣應(yīng)該用于重組膠原蛋白的定量檢測(cè)。
熒光標(biāo)記的重組膠原蛋白的檢測(cè)可用酶標(biāo)儀或熒光分光光度計(jì)測(cè)定皮上、皮中和皮下部分的熒光值，用熒光標(biāo)記物制備重組膠原蛋白濃度-熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，換算體外透皮吸收試驗(yàn)皮上、皮中和皮下的受試物的含量。
由于分析的樣本涉及皮上、皮中和皮下三部分，且不同的基質(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)有影響，因此檢測(cè)皮上、皮中和皮下樣本的檢測(cè)方法均需要進(jìn)行方法驗(yàn)證。定量檢測(cè)的方法驗(yàn)證應(yīng)考慮方法的定量限，精密度和準(zhǔn)確度；
定量檢測(cè)應(yīng)計(jì)算體外透皮吸收試驗(yàn)中待測(cè)物在每個(gè)擴(kuò)散池的回收率，且討論回收率的合理性。
a) 原始樣本中待測(cè)物含量測(cè)定（a0）。
b) 皮上待測(cè)物含量（a1）：皮膚組織表面洗出物的重組膠原蛋白含量，可包括皮膚清洗液、供給池清洗液等部分。
c) 皮中待測(cè)物含量（a2）：皮膚組織中重組膠原蛋白含量，將皮膚剪碎或磨碎后用接收池溶液進(jìn)行提取。
d) 皮下待測(cè)物含量（a3）：接收液中重組膠原蛋白的含量，包括不同時(shí)間點(diǎn)的接收液、接收池清洗液等部分。
e) 受試物回收率計(jì)算：
式中：
a0——原始樣本中待測(cè)物含量測(cè)定；
a1——皮上待測(cè)物含量；
a2——皮中待測(cè)物含量；
a3——皮下待測(cè)物含量。
6.3.2 定性檢測(cè)
試驗(yàn)中至少1個(gè)樣品平行樣應(yīng)用于重組膠原蛋白在皮膚組織中分布的定性檢測(cè)。
進(jìn)行皮上部分待測(cè)物清洗后，從離體皮膚組織取下約1 cm×1 cm大小的組織塊，或浸沒(méi)于多聚甲醛 固定液后進(jìn)行冷凍切片，或直接包埋于OCT速凍后進(jìn)行冷凍切片。將制作好的冰凍切片進(jìn)行封片后使用 熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光成像，觀察皮膚組織中的重組膠原蛋白的熒光分布。
6.4 受試物透皮評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
受試物中重組膠原蛋白是否透皮，應(yīng)結(jié)合定量檢測(cè)數(shù)據(jù)和定性檢測(cè)結(jié)果綜合判斷。
a) 若皮中待測(cè)物含量大于或等于零，而皮下待測(cè)物含量為零，（即a2≥0，a3=0），應(yīng)結(jié)合定性檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷，觀察熒光標(biāo)記的重組膠原蛋白殘留部位。若熒光僅出現(xiàn)在角質(zhì)層、皮膚附件（包括毛囊、汗腺和皮脂腺）、或創(chuàng)傷部位，則認(rèn)為受試物不透皮吸收。若還出現(xiàn)在了上述 皮膚組織之外的其它部位，建議進(jìn)一步參考體內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。
b) 若a3＞0，則認(rèn)為透皮吸收。
7、 試驗(yàn)數(shù)據(jù)和報(bào)告
7.1 數(shù)據(jù)
應(yīng)列出皮上、皮中和皮下部分各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的重組膠原蛋白濃度，累計(jì)總量，占理論上樣總量的比例。
7.2 試驗(yàn)報(bào)告
試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包含方案中規(guī)定的需求，除包括應(yīng)用試驗(yàn)系統(tǒng)的證明外，還應(yīng)包含以下內(nèi)容：
a) 受試物：
1) 重組膠原蛋白分子量；
2) 重組膠原蛋白標(biāo)記所選用熒光分子，標(biāo)記方法簡(jiǎn)述；
3) 重組膠原蛋白的標(biāo)記率；
4) 受試物制備方法；
5) 受試物穩(wěn)定性考察。
b) 試驗(yàn)條件：
1) 皮膚來(lái)源和位置、制備方法、使用前的儲(chǔ)藏條件、所有預(yù)處理(清洗、抗生素處理等)、皮膚完整性測(cè)量、代謝狀況等；
2) 創(chuàng)面造模的方法、使用的理由等；
3) 擴(kuò)散池的設(shè)計(jì)、接收液的組分、接收液的溫度、采樣次數(shù)和規(guī)程；
4) 分組設(shè)置、上樣量、上樣方法、上樣時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)；
5) 皮上部分重組膠原蛋白回收的詳細(xì)操作；
6) 皮中部分重組膠原蛋白回收的詳細(xì)操作；
7) 皮下部分重組膠原蛋白回收的詳細(xì)操作；
8) 檢測(cè)方法、定量限確定的方法，以及分析方法的有效性；
9) 組織切片過(guò)程的詳細(xì)操作。
c) 結(jié)果：
1) 皮上、皮中和皮下受試物檢測(cè)的方法驗(yàn)證結(jié)果；
2) 皮上、皮中和皮下部分各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的重組膠原蛋白濃度，累計(jì)總量，占理論上樣總量的比例；
3) 皮上、皮中和皮下部分的每個(gè)反應(yīng)池的受試物回收率；
4) 組織切片結(jié)果；
5) 透皮與否的判斷。
d) 結(jié)果討論：
結(jié)合方法驗(yàn)證結(jié)果，討論受試物回收率的合理性。結(jié)合受試物回收率結(jié)果及組織切片結(jié)果討論 受試物透皮吸收情況。
e) 結(jié)論
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