霉菌酵母菌在自然界中分布極廣，種類繁多，食品中易受到不同程度的污染。食品中霉菌酵母菌的增殖一般會(huì)導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降、酸敗變味或外觀惡化等，影響貨架期及口感，若霉菌、酵母菌含量較高，且日攝入量較多，會(huì)影響人體腸胃內(nèi)的微生物平衡，甚至造成腸胃不適，可能引起疾病發(fā)生。霉菌對(duì)干食品的最大風(fēng)險(xiǎn)主要是在適宜的條件下(產(chǎn)毒株、數(shù)量、溫度、濕度、水分活度等），能產(chǎn)生霉菌的有毒代謝產(chǎn)物—霉菌毒素，引起過(guò)敏反應(yīng)等各種急、慢性中毒及可能的致癌作用。因此，人們愈來(lái)愈重視食品中霉菌及酵母菌污染對(duì)人體造成的危害。
在我國(guó)國(guó)家部分食品產(chǎn)品及衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中，把霉菌和酵母菌作為常見(jiàn)指示菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制，如飲料、堅(jiān)果制品、米面制品、糕點(diǎn)類等食品。霉菌和酵母的檢測(cè)被列入國(guó)標(biāo)4789 系列食品安全微生物常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目之一 , 霉菌酵母菌的檢驗(yàn)方法看似簡(jiǎn)單，但由于食品種類繁多成分復(fù)雜，食品中存在的霉菌種類較多，對(duì)環(huán)境溫濕度及營(yíng)養(yǎng)成分的要求有所不同，要在同等條件下把所有的霉菌培養(yǎng)出來(lái)，反映出樣品的真實(shí)情況，實(shí)屬不易，且霉菌前期生長(zhǎng)速度緩慢，后期菌絲急劇增加，特別是毛霉的蔓延，給霉菌和酵母菌的同時(shí)計(jì)數(shù)帶來(lái)一定的困難，如何能更準(zhǔn)確、快速提離食品中霉菌檢測(cè)數(shù)目是食品衛(wèi)生部門(mén)面臨的一個(gè)嚴(yán)峻問(wèn)題。
能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)判定實(shí)驗(yàn)室的特定校準(zhǔn)、檢測(cè)能力，以考察實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)?zāi)芰Φ耐獠抠|(zhì)量活動(dòng),組織方提供試驗(yàn)的樣本，一般會(huì)考慮增加檢測(cè)難度。為了更準(zhǔn)確更全面得出能力驗(yàn)證結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)室綜合了多種方法進(jìn)行同步檢測(cè)，主要是考慮霉菌、酵母菌總數(shù)檢測(cè)是通過(guò)平板中生長(zhǎng)的菌落數(shù)目直接計(jì)數(shù)推算，培養(yǎng)基的質(zhì)量和培養(yǎng)方式直接影響了檢測(cè)的結(jié)果，因此，選擇兩種常用的霉菌酵母培養(yǎng)基，采用正置和倒置培養(yǎng)法進(jìn)行試驗(yàn)，比較分析不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)方式對(duì)霉菌酵母菌計(jì)算結(jié)果的差異，進(jìn)而得出較為準(zhǔn)確的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行上報(bào)。
2、 材料與方法
2.1 樣品
能力驗(yàn)證樣品：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供，樣品編號(hào)為15-G068。
2.2 培養(yǎng)基及試劑
孟加拉紅瓊脂（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、馬鈴薯－葡萄糖－瓊脂培養(yǎng)基瓊脂（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、0.85%無(wú)菌生理鹽水（自制）。
2.3 試驗(yàn)儀器
SHP-250 生化培養(yǎng)箱（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、高壓滅菌鍋（廈門(mén)致微生物科技有限公司)、生物安全柜(Heal ForceSafe 1200TE)。
2.4 試驗(yàn)方法
2.4.1 樣品處理
按照作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，樣品總計(jì)用40ml稀釋液 ，開(kāi)啟后先用4ml稀釋液水化樣品，溶解后吸出無(wú)菌瓶中，再反復(fù)用剩余的稀釋液沖洗西林瓶?jī)?nèi)壁，回收清洗液。此溶液即為待測(cè)樣品原液，再按無(wú)菌操作稀釋至10-5。
2.4.2 孟加拉紅培養(yǎng)基傾注法
樣品稀釋后，選擇合適稀釋度，取lmL置無(wú)菌平皿中，然后傾注1 5~ 20 mL孟加拉紅培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，分別使用正置和倒置方式于培養(yǎng)箱內(nèi)28℃±1℃培養(yǎng)5天, 每個(gè)稀釋度進(jìn)行三次平行重復(fù)。
2.4.3 馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基傾注法
樣品稀釋后，選擇合適稀釋度，取lmL置無(wú)菌平皿中，然后傾注15~20mL馬鈴薯 －葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，分別使用正置和倒置方式于培養(yǎng)箱內(nèi)28℃±1℃培養(yǎng)5天,每個(gè)稀釋度進(jìn)行三次平行重復(fù)。
3、 結(jié)果
3.1 霉菌生長(zhǎng)計(jì)數(shù)
選擇孟加拉紅培養(yǎng)基和馬鈴薯－葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基，分別采用正置和倒置兩種培養(yǎng)方式進(jìn)行霉菌的培養(yǎng)，結(jié)果如表1所示。在孟加拉紅培養(yǎng)基中，正向放置培養(yǎng)方式霉菌數(shù)量比倒置培養(yǎng)方式高10.3%(RSD=6.96%)；在馬鈴薯－葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基中，正向放置培養(yǎng)方式霉菌數(shù)量比倒置培養(yǎng)方式高7.1%（RSD=4.88%)。在正向放置培養(yǎng)方式中，孟加拉紅培養(yǎng)基中霉菌數(shù)量比馬鈴薯－葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基高6.7%（RSD=4.56%); 在倒置培養(yǎng)方式中，孟加拉紅培養(yǎng)基中霉菌數(shù)量比馬鈴薯－葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基高3.6%（RSD =2.48%)。
表 1 不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)方式君菌的計(jì)數(shù)情況
3.2 酵母菌生長(zhǎng)計(jì)數(shù)
由于酵母菌和霉菌同屬于真菌，生長(zhǎng)溫度和需要的營(yíng)養(yǎng)條件一致，因此，與霉菌同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，采用同一培養(yǎng)基及培養(yǎng)方式，培養(yǎng)相同的時(shí)間進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明在孟加拉紅培養(yǎng)基中，正向放置培養(yǎng)方式酵母菌數(shù)量比倒置培養(yǎng)方式高20.0%（RSD=12.86%）；在馬鈴薯－葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基中，正向放置培養(yǎng)方式酵母菌數(shù)量比倒置培養(yǎng)方式高12.5%（RSD=8.32%)。兩種培養(yǎng)基中，無(wú)論是正向培養(yǎng)還是倒置培養(yǎng)方式，酵母菌總數(shù)含量大致相同。
表2 不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)方式酵母菌的計(jì)數(shù)情況
4、討論
總之霉菌酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果表明，兩種培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果總體無(wú)明顯差異，孟加拉紅培養(yǎng)基霉菌生長(zhǎng)率略高于馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基，這也是由于培養(yǎng)基的成分有所不同所致，培養(yǎng)基中葡萄糖的含量會(huì)影響霉菌的檢出率.正置培養(yǎng)霉菌酵母茵數(shù)量均高于倒置培養(yǎng)數(shù)量，霉菌培養(yǎng)中正置，有助于培養(yǎng)過(guò)程中的觀察，同時(shí)也避免了霉菌孢子脫落到培養(yǎng)基其他部位而引起最后計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確；此外，正置培養(yǎng)方式，培養(yǎng)基表面的水分增多能更好的提供霉菌酵母菌生長(zhǎng)所需要的濕度，檢出數(shù)值略高。本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)至第3天時(shí)，平板上已經(jīng)生長(zhǎng)了較小的霉菌菌落，第4天時(shí)，即生長(zhǎng)了清晰的白色的酵母菌落，在培養(yǎng)至第5天時(shí)，霉菌的菌絲已經(jīng)開(kāi)始罷蓋莖延到整個(gè)平板，因此，選擇了在培養(yǎng)至第4天時(shí)，進(jìn)行計(jì)數(shù)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在進(jìn)行霉菌、酵母菌的能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，主要考慮采用質(zhì)量合格的培養(yǎng)基及正確培養(yǎng)方式，主要應(yīng)注意以下幾個(gè)方面：
1) 樣品要稀釋到足夠的倍數(shù)，因?yàn)槊咕湍妇谝黄鹩?jì)數(shù)，霉菌菌落較大，要求同一個(gè)平板上菌落數(shù)不能過(guò)多，否則，難以計(jì)數(shù)。
2）采用質(zhì)量合格的孟加拉紅瓊脂和馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基，均可給出合格的結(jié)果。
3）建議采用正置培養(yǎng)方式，有利于觀察和中途計(jì)數(shù)，提高檢出率。
4）培養(yǎng)條件控制。應(yīng)提供霉菌酵母菌生長(zhǎng)的最優(yōu)條件，溫度為28度，保證環(huán)境濕度在60%以上。
5）應(yīng)選擇較早時(shí)間進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，最好在48小時(shí)后就開(kāi)始觀察 ，霉菌的過(guò)量生長(zhǎng)，大量的菌絲會(huì)使菌落互相交錯(cuò)，即影響了霉菌的計(jì)數(shù)，也將酵母菌覆蓋，從而造成不能準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。
6）霉菌、酵母茵應(yīng)分開(kāi)計(jì)數(shù)，樣品中的霉菌酵母菌的數(shù)量一般不在一個(gè)數(shù)量級(jí)范圍，應(yīng)在不同稀釋度的平板上分開(kāi)計(jì)數(shù)， 同時(shí)應(yīng)注意霉茵和酵母菌的形態(tài)區(qū)別，必要時(shí)采用鏡檢方法區(qū)分霉菌酵母菌。
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