2023年11月6日，F(xiàn)DA國家毒理學(xué)研究中心Weida Tong等人在nature communication上發(fā)表名為《A generative adversarial network model alternative to animal studies for clinical pathology assessment》的文章，旨在討論利用生成對抗網(wǎng)絡(luò)（generative adversarial network,GAN）模型代替動物實驗用于臨床病理學(xué)評估。
背景
在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域中，動物實驗對于理解疾病進展、發(fā)現(xiàn)預(yù)后/診斷生物標志物、風(fēng)險和安全性評估以及開發(fā)新治療方案至關(guān)重要。盡管動物實驗提供了與臨床實踐相似的多維信息，但當前關(guān)注已從傳統(tǒng)的動物實驗轉(zhuǎn)向評估藥物在人體中的應(yīng)用安全性。FDA現(xiàn)代化法案2.0強調(diào)了探索新方案的需求，而新方案支持動物實驗的替代、減少和改進（replacement，reduction，refinement，即3R原則）。
人工智能（Artificial Intelligence, AI）技術(shù)在許多領(lǐng)域日益革新，毒理學(xué)中的 AI發(fā)展很有可能找到支持3R的風(fēng)險評估替代方法。毒理學(xué)中的大多數(shù)AI主要用于分析和處理數(shù)據(jù)來識別模式并進行預(yù)測，如定量構(gòu)效關(guān)系（QSARs）。這些方法常側(cè)重于毒理學(xué)效應(yīng)的籠統(tǒng)概念（如毒性或非毒性）的單一終點。相反，基于動物的毒性評價提供更豐富、多維的信息，包括毒素基因組學(xué)和臨床病理學(xué)信息，來支持風(fēng)險評估和決策。
近來，生成式AI獲得了很多關(guān)注，如chatGPT。生成式AI如GAN可以創(chuàng)造新的內(nèi)容，通過學(xué)習(xí)傳統(tǒng)的動物實驗結(jié)果來生成未檢測化合物的動物數(shù)據(jù)從而提供一種代替動物實驗的方法。作者報告了一種用GAN方法開發(fā)的生成式AI叫做AnimalGAN，用于動物實驗。AnimalGAN能夠模擬虛擬的動物實驗生成類似于傳統(tǒng)動物實驗的多維數(shù)據(jù)。具體而言，AnimalGAN利用傳統(tǒng)的動物實驗數(shù)據(jù)，建立藥物暴露（藥物、藥物劑量和暴露持續(xù)時間結(jié)合）與臨床病理學(xué)發(fā)現(xiàn)（如臨床化學(xué)和血液學(xué)指標）的聯(lián)系來生成未檢測的新藥在預(yù)定劑量和治療時間內(nèi)的臨床病理學(xué)概況。
作者證明了即使未檢測新藥與訓(xùn)練集的藥物在化學(xué)結(jié)構(gòu)、藥物類別、FDA批準的年份顯著不同的情況下，仍表現(xiàn)出顯著的穩(wěn)健性。相比傳統(tǒng)的毒理學(xué)計算方法，AnimalGAN在預(yù)測臨床病理學(xué)指標方面優(yōu)于12種傳統(tǒng)定量構(gòu)效關(guān)系方法（QSAR）。此外，在評估藥物的肝臟毒性方面，AnimalGAN結(jié)果與動物實驗相當。在3R科學(xué)中，最關(guān)鍵的爭論之一是動物實驗并不總是能夠準確預(yù)測復(fù)雜情況下（如特殊藥物引起的肝損傷）的人類結(jié)果。然而，該研究人員發(fā)現(xiàn)，AnimalGAN通過無限次實驗（資源允許的情況下）可以對不同個體動物的臨床病理數(shù)據(jù)進行群體的近似估計，這有可能發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)動物實驗不太可能識別的罕見毒理學(xué)事件從而改善動物研究向人類結(jié)果的轉(zhuǎn)化。
結(jié)果
AnimalGAN的開發(fā)
在當前的研究中，AnimalGAN生成了38種臨床病理學(xué)指標，其中測試化合物用化學(xué)描述符表示，研究條件包括治療持續(xù)時間（3天、7天、14天和28天）和劑量組（高、中、低）。
AnimalGAN模型是在來自O(shè)pen Toxicogenomics Project-Genomics Assisted Toxicity Evaluation Systems（TG-GATEs）數(shù)據(jù)庫的6442只大鼠數(shù)據(jù)（作為訓(xùn)練集），對應(yīng)于1317種治療方案下（包括化合物-劑量-時間的組合）的110種化合物（其中大多數(shù)是藥物）進行開發(fā)的，采用了混合的生成對抗網(wǎng)絡(luò)（GANs）架構(gòu)（圖1a）。然后相同TG-GATEs數(shù)據(jù)庫的1636只大鼠數(shù)據(jù)作為測試集來進行模型評估，測試集包括332種治療方案下的28種不同化合物（圖1b）。
圖1. AnimalGAN模型開發(fā)
在測試集中觀察到生成數(shù)據(jù)和真實的臨床病理學(xué)指標之間高度一致性（圖2c均方根誤差RMSE17.58，顯著小于背景對照的中位數(shù)72.46，Wilcoxon秩和檢驗p值2.48×10-169）；高余弦相似性（圖2d, 1.00，顯著高于中位背景對照值0.98，Wilcoxon秩和檢驗p值1.45×10-181)。t-SNE（T分布隨機近鄰嵌入）降溫可視化顯示了測試集的生成數(shù)據(jù)與真實臨床病理學(xué)指標之間的高度相似性（圖2e）。
圖2. AnimalGAN模型評價
AnimalGAN方法評估
AnimalGAN方法在訓(xùn)練/測試集分離策略上有三方面的難點，證明了AnimalGAN用于未檢測藥物結(jié)果的可行性和可靠性；測試藥物包括1）化學(xué)結(jié)構(gòu)與建模使用的藥物結(jié)構(gòu)完全不同；2）治療類別不在AnimalGAN開發(fā)的范圍內(nèi)，3）相比于構(gòu)建AnimalGAN模型的藥物，測試藥物最近才獲得FDA批準。在這三種不同的情境中，衍生的AnimalGAN模型在相應(yīng)的測試集上產(chǎn)生了與原始AnimalGAN模型相同的結(jié)果。在三個場景的生成數(shù)據(jù)和真實數(shù)據(jù)之間的余弦相似性中位數(shù) > 0.99（顯著高于背景對照的中位數(shù)0.98，P < 5.65×10-140），而中位均方根誤差 < 20.18（顯著小于中位背景對照72.46，P < 4.80×10-141）（圖3）。此外，在三種場景中，生成數(shù)據(jù)和真實數(shù)據(jù)中38項臨床病理學(xué)指標的相關(guān)性與原始AnimalGAN模型觀察到的結(jié)果相當。作者強調(diào)了第一種極端情況，當化合物的結(jié)構(gòu)信息是開發(fā)預(yù)測模型的唯一輸入時存在一些擔憂，如適用領(lǐng)域和活性懸崖；所謂活性懸崖是指化合物結(jié)構(gòu)中微小的改變會導(dǎo)致生物活性顯著變化。為緩解這些擔憂，將藥物的暴露信息（藥物劑量和治療持續(xù)時間）納入模型中確保在真實世界中具有強大的適用性。
圖3. AnimalGAN模型在三種完全不同的真實世界場景的評估
AnimalGAN VS 傳統(tǒng)人工智能
作者比較了AnimalGAN結(jié)果與38項臨床病理學(xué)指標的每一項QSAR分析進行了比較。對于每項指標，作者采用與AnimalGAN完全相同的試驗設(shè)計和輸入（描述符和暴露信息）開發(fā)了12個回歸模型。AnimalGAN的預(yù)測值與真實值之間的均方誤差比所有QSAR模型對每項臨床病理學(xué)指標的預(yù)測值與真實值之間的方差小得多。值得注意的是，38項臨床病理學(xué)指標的每一項都開發(fā)了一個單獨的QSAR模型，而AnimalGAN同時生成38項指標的數(shù)據(jù)。
AnimalGAN應(yīng)用
動物數(shù)據(jù)用于毒理學(xué)評估的常見情景是，將治療組的觀察結(jié)果與其時間匹配對照組的觀察結(jié)果進行比較以確定安全范圍。作者比較了此情景下真實動物實驗數(shù)據(jù)與AnimalGAN結(jié)果，測試集中觀察到高度一致（即96.08% - 100%）。在臨床和臨床前研究的情況下，所預(yù)測的38項臨床病理指標中，7項用于肝毒性評估（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST、乳酸脫氫酶LDH、堿性磷酸酶ALP、γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)肽酶GTP、總膽紅素TBIL和直接膽紅素DBIL），另7項用于腎毒性評估（尿素氮BUN、肌酐CRE、鈉、鉀、氯、鈣和無機磷）?；贏nimalGAN的評估與動物研究中肝毒性和腎毒性一致性分別為96.08%-100%和97.89%-100%（圖4），表明AnimalGAN在無動物試驗中的潛在用途。
圖4. AnimalGAN模型毒性評估
毒性評價中DrugMatrix數(shù)據(jù)的外部驗證
使用DrugMatrix數(shù)據(jù)集對AnimalGAN進行外部驗證。臨床病理學(xué)指標在不同的實驗方案或不同的實驗室之間可能差異很大。為此，作者分析了TG-GATEs和DrugMatrix都測試過的70種常見化合物（對應(yīng)175種治療情況）的實驗數(shù)據(jù)，建立實驗設(shè)置中的基線一致性。25項常見指標在兩個數(shù)據(jù)集之間的總體平均一致性是81.20%。對于717種治療方案下的355個化合物，AnimalGAN生成的結(jié)果和DrugMatrix的真實數(shù)據(jù)一致性是82.85%。作者還比較了25項臨床病理學(xué)指標基線設(shè)置的一致性比較（圖5a）。此外，作者還比較了訓(xùn)練集中的110個化合物和外部驗證的355個化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示重疊并不顯著(圖5b)，表明模型對不同結(jié)構(gòu)的化合物可能具有廣泛的適用性。
圖5. AnimalGAN模型的外部驗證
AnimalGAN預(yù)測特異性藥物引起的肝損傷（idiosyncratic drug-induced liver injury, iDILI）
由于AnimalGAN是一個虛擬動物模型，可以模擬許多大鼠的臨床病理分布，其結(jié)果可能預(yù)測人群中罕見的有害事件，從而將臨床前的發(fā)現(xiàn)有效地轉(zhuǎn)化為臨床實踐。例如，iDILI很少見，即使在臨床試驗后期也無法檢測到，而臨床前的研究更加難以預(yù)見。因此，iDILI僅在上市后監(jiān)測中報告，在美國也是導(dǎo)致藥物撤回和急性肝功能衰竭的主要原因。監(jiān)測iDILI是藥物警戒中最具挑戰(zhàn)性的領(lǐng)域之一，因為動物和人體研究中有限的樣本量不能夠提供足夠的統(tǒng)計學(xué)意義。作者用AnimalGAN進行了一項28天的虛擬研究來生成十萬只大鼠的肝酶數(shù)據(jù)，這些大鼠分別用troglitazone、pioglitazone和rosiglitazone進行高劑量治療。Thiazolidinediones是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的家族藥物，用于治療2型糖尿病。其中，Troglitazone由于發(fā)生iDILI的頻率和嚴重程度較高而撤市，而pioglitazone和rosiglitazone因為iDILI發(fā)生的頻率較?。ú坏?%）和嚴重程度較輕（大多數(shù)是輕度和可逆）。作者通過大量模擬，利用肝酶（傳統(tǒng)用于評估DILI）高于正常上限的大鼠數(shù)量來檢驗這三種藥物DILI風(fēng)險的差異；這些指標分別是ALT、AST和TBIL，ALT和AST評估肝臟受損的程度，而TBIL顯示肝功能的喪失。采用經(jīng)典的醫(yī)學(xué)法則（Hy’s Law）將ALT（或AST）與TBIL結(jié)合評估臨床環(huán)境中藥物誘導(dǎo)性肝損傷的整體風(fēng)險。Troglitazone組肝酶升高（除ALT外）的大鼠多于其他組的大鼠。此外，就ALT（或AST）與TBIL結(jié)合評估的總體DILI風(fēng)險而言，Troglitazone的DILI頻率比其他兩種藥物高出兩倍多，與實際情況相符。
討論
全球各地正在積極推動無動物實驗的研究，包括FDA現(xiàn)代化法案、FDA預(yù)測毒理學(xué)路線圖、Tox21計劃以及歐洲的ONTOX。這反映了對計算毒理學(xué)，以及取代傳統(tǒng)動物實驗的日益重視。計算毒理學(xué)領(lǐng)域長期依賴于類似QSAR的方法，但這些方法通常只能預(yù)測籠統(tǒng)概念的單一終點，缺乏關(guān)鍵的具體信息。相比之下，基于動物的毒性評估提供了更豐富、多維的信息支持風(fēng)險評估和決策。
AnimalGAN作為一種生成式AI，致力于模擬生成多維毒理學(xué)信息，以更全面地反映傳統(tǒng)臨床前毒理評估。與傳統(tǒng)的QSAR方法相比，AnimalGAN在預(yù)測臨床病理學(xué)指標方面表現(xiàn)出色。作者使用DrugMatrix數(shù)據(jù)集進行了AnimalGAN的驗證，雖然存在一些實驗設(shè)計上的差異，但AnimalGAN與實驗數(shù)據(jù)在毒性評估中顯示出大約83%的一致性，證明了其應(yīng)用潛力。AnimalGAN不僅在預(yù)測準確性上具有優(yōu)勢；相較于QSAR一次只能預(yù)測一個終點，AnimalGAN還能一次生成完整的毒理學(xué)特征報告。該技術(shù)為評估人類種群中罕見的不良事件提供了可能的途徑，從而改善對于藥物安全性的評估。盡管AnimalGAN是一項有潛力的技術(shù)，但研究者也強調(diào)了AnimalGAN目前的局限性，特別是在化學(xué)結(jié)構(gòu)相對有限的情況下。未來的研究可以通過對更廣泛的動物數(shù)據(jù)進行學(xué)習(xí)，進一步提高AnimalGAN的穩(wěn)健性和適用性。
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