導(dǎo)語(yǔ)
抗體偶聯(lián)藥物(ADC)是一類新興的生物治療藥物，由抗體、連接子和小分子細(xì)胞毒素三部分組成。與傳統(tǒng)抗體藥物相比，結(jié)構(gòu)會(huì)更加復(fù)雜，其復(fù)雜程度受抗體種類、偶聯(lián)方式、連接子與毒素種類等多個(gè)因素影響。因此ADC分析方法的建立具有特殊性，分析方法很難做到完全平臺(tái)化，需要根據(jù)每類ADC的自身質(zhì)量屬性的特點(diǎn)進(jìn)行差異化開(kāi)發(fā)。隨著越來(lái)越多復(fù)雜形式ADC分子的出現(xiàn)，如何合理且準(zhǔn)確地看到ADC特有的各類質(zhì)量屬性將是未來(lái)的難點(diǎn)和挑戰(zhàn)。本文就ADC分析與表征的基礎(chǔ)技術(shù)做簡(jiǎn)要介紹探討。
ADC產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Attributes, CQA）舉例如下圖所示。根據(jù)先驗(yàn)知識(shí)和平臺(tái)經(jīng)驗(yàn)，與分子安全性和有效性相關(guān)的物理、化學(xué)、生物或微生物性質(zhì)及特征，均可納入關(guān)鍵質(zhì)量屬性，且需隨產(chǎn)品開(kāi)發(fā)階段的進(jìn)步而不斷加深研究。ADC主要的關(guān)鍵質(zhì)量屬性包括一級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、純度與雜質(zhì)、載藥量與藥物分布（Drug-to-Antibody Ratio, DAR）、含量、效價(jià)以及其他必須的生物制品質(zhì)量屬性。
本文將從載藥量與藥物分布、游離藥物、分子大小變異體和電荷變異體四個(gè)方面進(jìn)行介紹，討論各類分析技術(shù)是如何靈活配合用于表征分析ADC質(zhì)量屬性。
DAR及其分布
DAR（Drug-to-Antibody Ratio），即藥物小分子與抗體分子的數(shù)量比例，可指示平均每個(gè)抗體上偶聯(lián)上的小分子藥物個(gè)數(shù)。DAR與ADC的療效和安全性直接相關(guān)，低載藥量（低DAR）會(huì)降低ADC的效力，而高載藥量（高DAR）會(huì)改變ADC分子的藥代動(dòng)力學(xué)和毒性。常規(guī)用于定量DAR的方法有光譜（UV-Vis）、色譜（HPLC）和質(zhì)譜（LCMS）等。如下圖所示，已上市ADC產(chǎn)品在DAR分析質(zhì)控上主要是光譜和色譜這兩類技術(shù)。
（1）光譜方法（UV-vis）
可實(shí)現(xiàn)DAR監(jiān)控需要有如下三個(gè)前提條件：
1）有效載荷應(yīng)含有紫外可見(jiàn)發(fā)色團(tuán)；
2）有效載荷和抗體在其紫外可見(jiàn)光譜中應(yīng)顯示出不同的吸收峰屬性；
3）連接子-有效載荷的存在不影響ADC樣品中抗體部分的光吸收性質(zhì)。
根據(jù)抗體部分和載荷部分的不同吸光度和消光系數(shù)，依據(jù)Beer-Lambert原理計(jì)算出DAR值及ADC濃度，典型圖譜及計(jì)算方式舉例如下
（2）色譜方法（HPLC）
常見(jiàn)的可用于DAR分析的色譜方法有疏水色譜（HIC）和反相色譜（RP）。疏水色譜利用不同載藥組分的疏水性質(zhì)差異進(jìn)行分離，不同的固定相（苯基、丁基、醚基等）具有不同的疏水性和選擇特性，采用高鹽濃度流動(dòng)相使蛋白結(jié)合到固定相，繼而降低鹽濃度進(jìn)行洗脫，這種溫和的結(jié)合與洗脫條件可以保持ADC藥物的天然構(gòu)象。HIC是可在完整分子水平上監(jiān)控DAR的最佳方法，可直接定量不載藥抗體（DAR0）組分，一般認(rèn)為D0為非有效組分且會(huì)占據(jù)ADC結(jié)合位點(diǎn)影響ADC內(nèi)吞。
反相色譜（RP）利用目標(biāo)分子之間的極性差異進(jìn)行分離，分離度較好，且方法本身質(zhì)譜兼容，可直接進(jìn)行不同載藥形式的分子量定性。反相方法也可直觀看到小分子藥物在不同位點(diǎn)的分布情況。如下圖所示，對(duì)于常規(guī)鏈間二硫鍵巰基偶聯(lián)的ADC分子，由于高載藥異質(zhì)性，需對(duì)樣品進(jìn)行還原后再進(jìn)行分析，目標(biāo)物非完整狀態(tài)，雖然可以監(jiān)控藥物在不同位點(diǎn)的分布，但無(wú)法定量完整的不載藥抗體DAR0的比例。
（3）質(zhì)譜方法（LC-MS）
質(zhì)譜方法是另一種常用的DAR分析技術(shù)。目前使用電噴霧電離(ESI)與飛行時(shí)間(TOF)或具有更大質(zhì)量范圍的Orbitrap可以以足夠的分辨率區(qū)分ADC的異質(zhì)分子物種。例如，在還原和非還原條件下，通過(guò)完整的質(zhì)量測(cè)量，可以獲得ADC分子的完整質(zhì)量分布。
以上三種常規(guī)分析技術(shù)擁有各自的優(yōu)點(diǎn)和最佳應(yīng)用場(chǎng)景，可按照ADC分子特點(diǎn)和所處的開(kāi)發(fā)階段，按需開(kāi)發(fā)或配置相應(yīng)的DAR定量方法。
游離藥物
所有ADC共有的一個(gè)重要質(zhì)量屬性是游離(未結(jié)合)藥物的數(shù)量，這會(huì)引起對(duì)毒性和潛在安全問(wèn)題的關(guān)注。未偶聯(lián)藥物或藥物相關(guān)雜質(zhì)的殘留量可能殘留在最終產(chǎn)品中。未偶聯(lián)藥物的相關(guān)形式，如連接藥物種類或其他降解產(chǎn)物，也可以在偶聯(lián)物存儲(chǔ)期間釋放。因此，開(kāi)發(fā)和應(yīng)用合適的方法來(lái)檢測(cè)、表征和量化游離藥物是至關(guān)重要的。常規(guī)的游離藥物監(jiān)控方法的開(kāi)發(fā)思路如下。
分子大小變異體
分子大小變異體(聚集體、片段等)是重要的質(zhì)量屬性，可直接影響蛋白質(zhì)療法的療效或安全性。聚集是蛋白質(zhì)最常見(jiàn)的物理降解途徑，且ADC比抗體更容易聚集，主要是因?yàn)樗幬?連接子分子的存在，使連接位點(diǎn)的局部表面具有更多的疏水性。與抗體分析的技術(shù)一致，體積排阻色譜（SEC）、光散射（SEC-MALS）等常規(guī)技術(shù)可用于支持ADC分子聚合體的分析表征，非還原/還原毛細(xì)管電泳（non-reduced/reduced Capillary Electrophoresis）可用于支持ADC片段的分析表征。
電荷變異體
與抗體一致，ADC的電荷變異體是關(guān)鍵的質(zhì)量屬性，因?yàn)樗鼈儗?duì)穩(wěn)定性和生物活性有潛在影響。在ADC中可以觀察到各種形式的與電荷相關(guān)的異質(zhì)性，貢獻(xiàn)這些異質(zhì)性的因素包括抗體自身展示的電荷變異性、偶聯(lián)工藝過(guò)程引入的修飾、小分子藥物本身的結(jié)構(gòu)以及在不同偶聯(lián)位點(diǎn)引起的電荷變化等。常規(guī)分析技術(shù)如離子交換色譜（Ion Exchange Chromatography，IEX）或者等點(diǎn)聚焦電泳（iCIEF）可以實(shí)現(xiàn)電荷變異體的監(jiān)測(cè)。常規(guī)的電荷變異體表征策略也適用于ADC分子，富集單一變異體組分后，進(jìn)行完整水平（Top-down）、亞基水平（Middle-down）或肽段水平（bottom-up）質(zhì)譜解析。
ADC作為一種抗癌治療極具潛力的藥物，引起越來(lái)越多的興趣。與單獨(dú)的抗體相比，ADC由于偶聯(lián)的異質(zhì)性而具有更高的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性。分析技術(shù)的改進(jìn)提供了更好的工具去表征這些產(chǎn)品，從而為ADC開(kāi)發(fā)人員提供工藝和處方開(kāi)發(fā)所需的信息，并確定質(zhì)量控制批放行和穩(wěn)定性測(cè)試所需穩(wěn)健耐用的方法。
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