前言
蛋白降解靶向嵌合體（即Proteolysis-Targeting Chimeras，在上下文中簡(jiǎn)稱為“PROTAC”）是由靶向蛋白的配體（protein targeting moiety, PTM）與泛素連接酶配體（ubiquitin ligase moiety, ULM）連接而成的異雙功能分子（圖1）。它們的功能是誘導(dǎo)靶蛋白與泛素連接酶接近，導(dǎo)致泛素轉(zhuǎn)移并隨后引起泛素蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)靶蛋白的降解。在過去的十年中，PROTAC作為新型治療藥物在學(xué)術(shù)界和制藥行業(yè)引發(fā)的關(guān)注呈現(xiàn)爆炸式增長(zhǎng)。
圖1. PROTAC與靶蛋白之間誘導(dǎo)的三聚體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)-PROTAC-E3連接酶
與此同時(shí)，開發(fā)口服PROTAC藥物的最大障礙，是實(shí)現(xiàn)有效的口服吸收。就其性質(zhì)而言，PROTAC不同于傳統(tǒng)的小分子藥物，不滿足經(jīng)典的類藥五原則（Rule of Five），但卻在臨床研究中被證明有口服吸收的潛力。最近，人們對(duì)擴(kuò)展五原則（eRo5）或者超越五原則（bRo5）的分子重新產(chǎn)生了興趣，Keith R. Hornberger和 Erika M. V. Araujo在Journal of Medicinal Chemistry雜志上發(fā)表了一篇文章，標(biāo)題為Physicochemical Property Determinants of Oral Absorption for PROTAC Protein Degraders。在這篇文章中，他們利用ARVINAS公司現(xiàn)有的PROTAC數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)影響PROTAC口服吸收的物理化學(xué)性質(zhì)因素進(jìn)行了全面的分析，討論了PROTAC在eRo5/bRo5空間中的位置，并針對(duì)口服PROTAC藥物的設(shè)計(jì)得出了幾個(gè)關(guān)鍵性結(jié)論。本文旨在對(duì)該文章進(jìn)行詳細(xì)的解讀，希望為PROTAC藥物的研發(fā)提供思路。
引入評(píng)價(jià)吸收的關(guān)鍵指標(biāo)摒利用度指標(biāo)棄常用的口服生物
口服生物利用度（F）的定義為F = fa × fg × fh，其中fa為吸收分?jǐn)?shù)，fg為胃腸道有效通過分?jǐn)?shù)，fh為肝有效通過分?jǐn)?shù)。口服吸收藥物經(jīng)肝門靜脈進(jìn)入肝臟，再經(jīng)肝臟首過代謝后進(jìn)入體循環(huán)， fh 可以定義為 1 -(Cl/Qh)，其中Cl為靜脈給藥的體內(nèi)清除率，Qh為肝血流量?？诜锢枚菷obs可在實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)比口服和靜脈給藥后的血藥濃度時(shí)間曲線下面積（AUC）得到，但fa × fg從定義上更能代表藥物從腸道吸收的情況。雖然很難通過實(shí)驗(yàn)直接測(cè)定fa或fg的值，但兩者的乘積可以估算，即fa × fg = Fobs /(1- (Cl/Qh ))。
許多先前將分子的物理化學(xué)性質(zhì)與口服生物利用度Fobs聯(lián)系起來進(jìn)行分析的方法是有一定缺陷的。為了說明這一點(diǎn)，Keith R. Hornberger和 Erika M. V. Araujo分析了表1中兩個(gè)化合物的情況。
表1. 口服生物利用度和腸道吸收情況存在潛在不一致
從表中可以看到，盡管兩個(gè)化合物的口服生物利用度均為5%，但是兩個(gè)化合物的腸道吸收能力差異較大。化合物A具有較高的肝臟清除率（90%肝血流量），而fa × fg為0.5，高肝臟清除是造成低口服生物利用度的主要因素?；衔顱的肝臟清除率相對(duì)比較低（10%肝血流量），而fa × fg僅為0.06，低的腸道吸收是造成低口服生物利用度的主要因素。因此，fa × fg相比Fobs更適用于評(píng)估化合物的腸道吸收情況，它將肝臟清除率因素對(duì)生物利用度影響排除在外。
根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定fa × fg的閾值為0.25
通常認(rèn)為一個(gè)比較令人滿意的吸收情況是化合物至少有20%的口服生物利用度和比較低的肝臟清除率（<25% Qh），計(jì)算得出的最小fa × fg約為0.26。因此，在后續(xù)的統(tǒng)計(jì)中，將fa × fg = 0.25設(shè)定為口服PROTAC分子一個(gè)閾值。
本次共有1806個(gè)PROTAC化合物參與了統(tǒng)計(jì)，選擇的種屬是大鼠，主要因?yàn)榇笫蟮撵o脈和口服PK數(shù)據(jù)比較全面，同時(shí)大鼠也是臨床前毒理實(shí)驗(yàn)常用的種屬。首先對(duì)這1806個(gè)化合物的fa × fg值進(jìn)行了計(jì)算和統(tǒng)計(jì)，從圖2的結(jié)果中可以看到75%的化合物顯示了低或中等的體內(nèi)清除，證明清除率不是影響口服吸收的主要因素。另外有233個(gè)化合物（約占13%）的清除率大于大鼠肝血流量，因此在后續(xù)的統(tǒng)計(jì)中剔除了這些清除率大于Qh（55 mL/min/kg）的分子，否則使用公式fa × fg = Fobs /(1- (Cl/Qh ))無法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行有意義的評(píng)估。
圖2. 大鼠中Cl/Qh 值的分布(n=1806)
在對(duì)剩余的1573個(gè)化合物進(jìn)行分析之前，首先對(duì)能同時(shí)得到大鼠和小鼠PK數(shù)據(jù)的1016個(gè)化合物進(jìn)行了分析，利用小鼠的肝血流量90 mL/min/kg和大鼠的肝血流量55 mL/min/kg分別進(jìn)行fa × fg計(jì)算，從圖3的結(jié)果中可以看到85%（861/1016）的PROTAC分子在大鼠中的fa × fg是低于在小鼠中的，即大多數(shù)PROTAC分子在大鼠體內(nèi)的口服吸收比小鼠差，在藥物吸收方面大鼠對(duì)于藥物的篩選更為嚴(yán)格。
圖3. 大鼠和小鼠fa × fg數(shù)據(jù)的對(duì)比
沖新定義口服P重ROTAC的理化性質(zhì)上限范圍
接著研究人員對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中PROTAC分子（n=1573）的理化性質(zhì)與大鼠fa × fg值的關(guān)系進(jìn)行了一個(gè)統(tǒng)計(jì)（圖4），結(jié)果概述如下：
氫鍵供體（HBD）有一個(gè)明顯的閾值，4個(gè)HBD達(dá)到fa × fg= 0.25 的上限。在經(jīng)過對(duì)結(jié)構(gòu)的分析后發(fā)現(xiàn)，幾乎所有（97%）HBD3或所有的HBD4都包含了1-2個(gè)分子內(nèi)被結(jié)合的氫鍵供體。因此，HBD的閾值可以表述為未結(jié)合的HBD數(shù)量小于等于2個(gè)。也就是說當(dāng)超過2個(gè)HBD時(shí)，可以引入分子內(nèi)氫鍵受體與氫鍵供體結(jié)合，減小HBD的數(shù)量限制。
氫鍵受體（HBA）的上限為15。
可旋轉(zhuǎn)氫鍵（RB）的上限為14，拓?fù)浞肿訕O性表面積（TPSA）的上限為200 Å2。而之前認(rèn)為要達(dá)到比較好的大鼠口服生物利用度，RB需要小于10，TPSA 要小于140 Å2。PROTAC的數(shù)據(jù)分析，擴(kuò)展了原先的范疇。
在分子量（MW）、ClogP/D方面，得出的值也大大超出了原先的類藥五原則：MW上限為950；ClogP為1-7；ClogD為0-6。
芳香環(huán)數(shù)（NAr）的上限為5，上限為4更佳。因?yàn)閮H有9%NAr為5的化合物得到較好的腸道吸收。
AB-MPS值（AbbVie multiparametric score）的計(jì)算方法為AB-MPS= ClogD + NAr + RB，AB-MPS被認(rèn)為比單個(gè)的參數(shù)更適合預(yù)測(cè)低口服吸收的風(fēng)險(xiǎn)，分析得出AB-MPS的上限為20（圖5）。
圖4. PROTAC分子的理化性質(zhì)與大鼠吸收的fa × fg值的關(guān)系
圖5. AB-MPS與大鼠吸收的fa × fg值的關(guān)系
表2總結(jié)了類藥五原則（Ro5），超越五原則（bRo5）以及口服PROTAC分子的理化性質(zhì)上限，這對(duì)于后續(xù)的研究具有較大參考意義。從結(jié)果上看，與傳統(tǒng)的Ro5相比，口服PROTAC分子的HBA、RB、TPSA、MW和ClogP都有了明顯的擴(kuò)展；而口服PROTAC分子的MW、HBA和ClogP與bRo5的上限比較接近。由于PROTAC分子的變色龍性質(zhì)，對(duì)于ClogP和TPSA的限制并沒有那么大。相比之下，如果想要達(dá)到比較好的吸收，口服PROTAC分子對(duì)HBD的限制比較嚴(yán)格。
表2. Ro5 、bRo5和口服PROTAC分子的理化性質(zhì)上限
應(yīng)用口服PROTAC理化性質(zhì)上限數(shù)據(jù)指導(dǎo)PROTAC分子設(shè)計(jì)
那么在實(shí)際研究中該如何應(yīng)用這些數(shù)據(jù)呢？首先，研究人員計(jì)算了兩個(gè)代表性的泛素連接酶配體（ULM）的理化參數(shù)，即CRBN和VHL（圖6），并且計(jì)算了20個(gè)常用的連接子的平均理化參數(shù)，從而建立了一個(gè)適合口服吸收的PROTAC分子的靶向蛋白配體PTM的預(yù)算圖（圖7）。在去除了ULM（藍(lán)色部分）和連接子（橙色部分）之后，剩余的即是給PTM留下的空間（綠色部分）。
圖6. 兩個(gè)代表性的ULM的結(jié)構(gòu)圖
圖7. 基于靶向(A) VHL或(B) CRBN作為E3連接酶配體的口服PROTACs的理化性質(zhì)預(yù)算分析
基于以上分析，可以得到一些結(jié)論：
首先，只有明智地選擇相對(duì)緊湊的ULM，才能得到較好的口服吸收。在口服藥物設(shè)計(jì)過程中避免使用特別大的ULM，比如VHL配體。在數(shù)據(jù)分析中也可以發(fā)現(xiàn)，基于VHL的PROTAC無論是在大鼠還是小鼠中fa × fg都很難達(dá)到0.25以上。
其次，即使有一個(gè)比較合適的ULM，在PTM的選擇上仍然有比較大的限制，比如很難找到一個(gè)同時(shí)滿足含有未結(jié)合的氫鍵供體≤1個(gè)、氫鍵受體≤9個(gè)、TPSA≤120 Å2、可旋轉(zhuǎn)氫鍵數(shù)量≤10且分子量≤488的PTM先導(dǎo)化合物。
上述分析中，假定連接子部分經(jīng)歷過優(yōu)化并具備藥物的性質(zhì)，若后續(xù)使用未經(jīng)修飾的PEG-或烷基型連接子，PTM的可用范圍將會(huì)進(jìn)一步縮小。
小結(jié)及展望
本文研究發(fā)現(xiàn)PROTAC在大鼠體內(nèi)的口服吸收比小鼠差。而在小鼠之外的種屬中，PROTAC的藥代數(shù)據(jù)報(bào)道有限。目前也有一些文獻(xiàn)報(bào)道PROTAC分子在小鼠中有著比較好的口服吸收，包括基于VHL設(shè)計(jì)的分子。對(duì)待這些數(shù)據(jù)需要十分謹(jǐn)慎，為了支持最終的臨床開發(fā)，獲得跨物種的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)是重要的。
本研究采用了一個(gè)經(jīng)驗(yàn)性的閾值，即fa × fg=0.25，但是一個(gè)藥效足夠好的PROTAC，在fa × fg小于0.25時(shí)也可能具備了足夠的臨床暴露量來驅(qū)動(dòng)療效。當(dāng)然，這些化合物在臨床前和臨床開發(fā)中可能面臨著一些其他的挑戰(zhàn)，比如要求在臨床前毒理學(xué)研究中達(dá)到的暴露量數(shù)倍于有效暴露量。
在未來，如果需要更好地發(fā)揮PROTAC分子的潛力，在分子設(shè)計(jì)上也提出了幾個(gè)需求，比如需要更多的篩選工作來找到新的緊湊的ULM和PTM。PTM篩選庫(kù)中化合物的理化性質(zhì)值得重新去思考并利用。采用PROTAC 體外ADME實(shí)驗(yàn)更好預(yù)測(cè)體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，是一項(xiàng)持續(xù)的需求。當(dāng)然也要更多地去關(guān)注PROTAC分子在非經(jīng)腸給藥方面的潛力，雖然在早期臨床階段的開發(fā)中更傾向于口服給藥，但是在某些情況下，出于靶點(diǎn)、患者群體的需求等考量，靜脈注射或皮下給藥可能更加合適。未來，也期待更多口服PROTAC分子的成功。
參考文獻(xiàn)：
[1]Keith R. Hornberger and Erika M. V. Araujo, Journal of Medicinal Chemistry, 2023 66 (12), 8281-8287
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
