當(dāng)血流通過(guò)動(dòng)脈受到限制時(shí)，就會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的肢體缺血（CLI），導(dǎo)致下游肢體潰瘍、壞死和慢性傷口。側(cè)枝小動(dòng)脈的發(fā)育(即動(dòng)脈生成)，無(wú)論是通過(guò)重塑已有血管網(wǎng)絡(luò)還是新生血管的重新生長(zhǎng)，都可以預(yù)防或逆轉(zhuǎn)缺血性損傷，但刺激側(cè)枝小動(dòng)脈的發(fā)育仍具有挑戰(zhàn)性。多因子策略雖然有著一定的效果但其臨床轉(zhuǎn)化的途徑變得復(fù)雜。因此，研究者開(kāi)發(fā)出了具有模擬可溶性蛋白質(zhì)活性的結(jié)合肽的水凝膠。
近日，來(lái)自美國(guó)范德比爾特大學(xué)的Ethan S. Lippmann團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種新的肽功能化水凝膠用于CLI治療。該研究使用明膠作為水凝膠骨架，用來(lái)自1型鈣粘蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的肽將明膠功能化，將其稱(chēng)為GelCad，然后使用支鏈胺反應(yīng)性聚乙二醇(PEG)聚合物原位交聯(lián)成水凝膠。研究表明，在使用再生能力有限的小鼠的嚴(yán)重股動(dòng)脈結(jié)扎模型中，GelCad水凝膠在體內(nèi)強(qiáng)有力地促進(jìn)側(cè)支小動(dòng)脈的發(fā)育，并防止缺血性損傷。
相關(guān)研究成果以“Growth factor free, peptide-functionalized gelatin hydrogel promotes arteriogenesis and attenuates tissue damage in a murine model of critical limb ischemia”為題于2023年11月13日發(fā)表在《Biomaterials》上。
1. 鈣粘蛋白肽偶聯(lián)明膠的合成與表征
基于之前的合成策略，作者進(jìn)一步使用EDC/NHS反應(yīng)將肽結(jié)合到明膠上，利用核磁證實(shí)了明膠上肽的存在(圖1A)。通過(guò)流變學(xué)、原子力顯微鏡和掃描電子顯微鏡測(cè)量，兩種交聯(lián)策略都產(chǎn)生了柔軟的多孔水凝膠(圖1B–E)，其基本性能適用于體內(nèi)使用。
圖1 GelCad水凝膠的表征
2. GelCad水凝膠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞向血管結(jié)構(gòu)的募集
先前的工作表明，血管損傷后SMC中的N-鈣粘蛋白表達(dá)上調(diào)，并調(diào)節(jié)SMC增殖，假設(shè)明膠中鈣粘蛋白模擬肽的存在會(huì)增強(qiáng)SMC對(duì)血管結(jié)構(gòu)的募集，從而促進(jìn)小動(dòng)脈的形成。為了評(píng)估這種可能性，作者將小鼠大腦皮層勻漿，暴露血管并模擬損傷情況。然后，將這種離體組織包埋到mTG交聯(lián)的明膠、GelCad或“GelScram”水凝膠中(后者含有鈣粘蛋白肽的混雜版本)。如?-SMA信號(hào)所示，相對(duì)于任一對(duì)照，包埋在GelCad水凝膠中的組織在24小時(shí)后在凝集素+血管樣結(jié)構(gòu)上具有顯著更高的SMCs覆蓋率(圖2)。
圖2 GelCad水凝膠促進(jìn)離體組織樣品中平滑肌細(xì)胞募集成血管樣結(jié)構(gòu)
3. 在注射到乳房脂肪墊后評(píng)價(jià)GelCad水凝膠中的小動(dòng)脈發(fā)育
接著，為了建立該研究的體外結(jié)果，作者接下來(lái)檢查了PEG交聯(lián)水凝膠在C57BL/6小鼠乳腺脂肪墊中的性能。水凝膠注射后，首先使用對(duì)比增強(qiáng)超聲檢查血管發(fā)育。在注射后第7天，可以在明膠和GelCad水凝膠的內(nèi)部檢測(cè)到大血管，在GelCad樣品中可能有更多的血管(圖3A)。然而，很難量化血管特征，因?yàn)樗z和周?chē)M織之間的絕對(duì)邊緣必須被估計(jì)和手工繪制。為了解決這個(gè)問(wèn)題，作者分離了完整的水凝膠用于冷凍切片和免疫組織化學(xué)。在GelCad水凝膠中，可以容易地在水凝膠中定位大量α-SMA+血管，指示小動(dòng)脈形成，而在明膠水凝膠中，可以定位一些假定的小動(dòng)脈，但是α-SMA信號(hào)強(qiáng)度低得多(圖3B)；總小動(dòng)脈數(shù)量的量化揭示了顯著差異(圖3C)，這反映了在圖2中的離體數(shù)據(jù)。
然后，作者使用Vesselucida軟件追蹤和量化水凝膠中的血管特征(圖3D)。在明膠和GelCad水凝膠中，可以檢測(cè)到直徑范圍從50到350微米的血管，表明有小動(dòng)脈。在GelCad水凝膠中，分支結(jié)的數(shù)量(表示血管分支點(diǎn))和血管體積(表示血管網(wǎng)絡(luò)的大小)明顯更高?？傊@些結(jié)果進(jìn)一步表明GelCad水凝膠增強(qiáng)了小動(dòng)脈的發(fā)育。
圖3 在小鼠脂肪墊中注射后評(píng)價(jià)GelCad水凝膠中的小動(dòng)脈發(fā)育
4. 在嚴(yán)重肢體缺血的小鼠模型中評(píng)價(jià)GelCad水凝膠的功效
作者在CLI的股動(dòng)脈結(jié)扎模型中評(píng)估GelCad水凝膠平臺(tái)的治療潛力。在14天的時(shí)間里，我們?cè)u(píng)估了用明膠、GelScram或GelCad水凝膠治療的小鼠以及接受生理鹽水的假對(duì)照小鼠的血流量、活動(dòng)性和組織質(zhì)量的恢復(fù)情況。與所有其他條件相比，用GelCad水凝膠治療的小鼠在結(jié)扎的肢體中有明顯更少的壞死；接受明膠水凝膠或鹽水的小鼠通常在第7至14天因嚴(yán)重壞死而失去肢體，這突出了該模型的嚴(yán)重性(圖4A和B)。使用Tarlov活動(dòng)性指數(shù)，作者還確定了接受GelCad水凝膠的小鼠在7天后活動(dòng)性恢復(fù)，而接受明膠水凝膠或鹽水的小鼠從未恢復(fù)活動(dòng)性(圖4C)。
圖4 股動(dòng)脈結(jié)扎和水凝膠遞送后小鼠的物理外觀和活動(dòng)性
這些結(jié)果反映了LDPI測(cè)量，其中接受GelCad水凝膠的小鼠在14天內(nèi)具有接近完美的灌注恢復(fù)(與健康腿的比例為1∶1 ),而用明膠水凝膠或鹽水治療的小鼠沒(méi)有表現(xiàn)出灌注恢復(fù)(圖5A和B)。為了進(jìn)一步證實(shí)側(cè)支發(fā)育，再次用不透射線的聚合物灌注小鼠，進(jìn)行μCT成像，并使用Vesselucida軟件追蹤和量化健康肢體與用GelCad水凝膠治療的結(jié)扎肢體的血管網(wǎng)絡(luò)。盡管結(jié)扎肢體缺乏通過(guò)股動(dòng)脈的血流，但結(jié)扎肢體的總血管長(zhǎng)度與健康肢體大致相當(dāng)，且血管直徑無(wú)顯著差異(圖5C-E)——這些數(shù)據(jù)表明通過(guò)增加側(cè)枝密度來(lái)補(bǔ)償血流。
圖5 股動(dòng)脈結(jié)扎和水凝膠遞送后灌注的恢復(fù)
最后，作者使用半定量指標(biāo)對(duì)肌變性、肌壞死、骨細(xì)胞損失、中心核、纖維化和骨髓壞死進(jìn)行了組織病理學(xué)評(píng)估(圖6)。相對(duì)于所有其他條件，用GelCad水凝膠治療的小鼠具有明顯較輕的肌肉退化以及肌肉和骨髓壞死。在用GelCad水凝膠治療的小鼠中，壞死幾乎完全不存在，但在所有其他情況下，壞死普遍存在。此外，在用GelCad水凝膠治療的小鼠中沒(méi)有觀察到骨細(xì)胞損失，而在其他條件下有輕微損失。因此，GelCad水凝膠防止由缺血性損傷引起的組織變性，可能是通過(guò)側(cè)枝發(fā)育快速恢復(fù)血流。
圖6 接受不同水凝膠治療的結(jié)扎后肢的組織病理學(xué)
在這些陽(yáng)性結(jié)果的支持下，作者選擇了兩只接受股動(dòng)脈結(jié)扎和GelCad水凝膠治療的小鼠，并將其老化5個(gè)月，以評(píng)估治療反應(yīng)的長(zhǎng)期持久性。在最后，小鼠具有正常的行走，并且在結(jié)扎的肢體中沒(méi)有可見(jiàn)的壞死跡象(圖7A)。LDPI成像顯示在結(jié)扎的和健康的肢體之間有接近1∶1的灌注比，表明側(cè)支網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)健和對(duì)來(lái)自股動(dòng)脈的減少的循環(huán)的持續(xù)補(bǔ)償(圖7B和C)。
但是在μCT圖像中對(duì)側(cè)枝網(wǎng)絡(luò)的追蹤揭示了總血管長(zhǎng)度的潛在增加，而不是血管直徑的增加，這潛在地暗示了在這個(gè)延長(zhǎng)的時(shí)間點(diǎn)上新側(cè)枝血管的生長(zhǎng)(圖7D–F)。因?yàn)榭梢哉J(rèn)為GelCad水凝膠產(chǎn)生了這種持久的反應(yīng)，未來(lái)的工作將集中在分析這些延長(zhǎng)的時(shí)間點(diǎn)，以更好地了解側(cè)枝發(fā)育的長(zhǎng)期機(jī)制，作為這些水凝膠的功能。
圖7 股動(dòng)脈結(jié)扎和用GelCad水凝膠治療后5個(gè)月的小鼠的評(píng)價(jià)
綜上，這項(xiàng)研究中評(píng)估了鈣粘蛋白肽功能化明膠水凝膠的動(dòng)脈生成活性。作者確定了該肽在將SMCs募集到血管中起著關(guān)鍵作用，這促進(jìn)了體外和體內(nèi)小動(dòng)脈的發(fā)育。在一個(gè)嚴(yán)重的CLI模型中，GelCad水凝膠有助于血流恢復(fù)，并在數(shù)月內(nèi)防止缺血性組織損傷?？偟膩?lái)說(shuō)，該研究表明GelCad水凝膠在CLI和其他有益于側(cè)支小動(dòng)脈發(fā)育的情況下具有很好的治療潛力。
文章來(lái)源：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2023.122397
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