微生物數(shù)據(jù)偏差是指微生物檢驗結(jié)果超出了藥典、GMP法規(guī)或企業(yè)建立的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或可接受標(biāo)準(zhǔn)。包括但不限于環(huán)境和水質(zhì)檢測、清潔驗證過程以及原料、制劑中間過程和成品檢測中產(chǎn)生的結(jié)果。
一、 制藥企業(yè)微生物偏差的調(diào)查應(yīng)該包括以下步驟：
定義微生物數(shù)據(jù)偏差：制定清晰的微生物數(shù)據(jù)偏差定義和分類，包括對異常結(jié)果的定義、原因和影響的分析。
收集數(shù)據(jù)：收集與微生物數(shù)據(jù)偏差相關(guān)的所有數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)資料，包括檢驗報告、驗證報告、質(zhì)量控制記錄等。
初步調(diào)查：對微生物數(shù)據(jù)偏差進(jìn)行初步調(diào)查，了解發(fā)生時間、頻率、范圍、影響等方面的情況，可以采用根本原因分析（RCA）等方法。
分析數(shù)據(jù)：對微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用統(tǒng)計方法分析原始數(shù)據(jù)，以確定數(shù)據(jù)是否具有顯著性。
尋找根本原因：針對微生物數(shù)據(jù)偏差進(jìn)行更深入的調(diào)查，確定根本原因，可以采用魚骨圖、5W1H等分析方法。
制定糾正和預(yù)防措施：確定根本原因后，制定糾正和預(yù)防措施，并在質(zhì)量管理系統(tǒng)中實施和記錄這些措施。
評估措施效果：對實施的措施進(jìn)行評估，以確保問題得到徹底解決，并記錄所有評估結(jié)果。
二、 階段I的微生物實驗室調(diào)查
實驗室調(diào)查的目的是建立檢驗結(jié)果的有效性，從而確認(rèn)已經(jīng)發(fā)生了偏差。如果已發(fā)生實驗室錯誤致使檢驗無效，QC部門將批準(zhǔn)對活性成分或成品/原料藥進(jìn)行復(fù)檢和/或重新取樣。企業(yè)QC微生物實驗室大小和復(fù)雜性各有不同。這些因素可能影響分析員和實驗室管理人員在培訓(xùn)、經(jīng)驗和學(xué)術(shù)背景方面處理偏差的經(jīng)驗水平。具體執(zhí)行過程可以參考FDA行業(yè)指南——制藥生產(chǎn)OOS結(jié)果調(diào)查進(jìn)行。
實驗室調(diào)查中最重要的兩個調(diào)查指標(biāo)包括超標(biāo)菌種鑒定情況和實驗室的無菌室管理水平。
1、菌種鑒定：
實驗室菌種鑒定是指對實驗室中分離出的微生物進(jìn)行分類和鑒定，以確定其種屬、亞屬和菌株等信息。菌種鑒定可以幫助實驗室進(jìn)行微生物檢測和質(zhì)量控制，確保實驗室中的微生物工作符合標(biāo)準(zhǔn)和要求。
以下是實驗室菌種鑒定的一般步驟：
分離純菌：首先需要從樣品中分離出單一的菌落并進(jìn)行純化，以避免不同菌種混雜導(dǎo)致的鑒定錯誤。
形態(tài)特征觀察：觀察菌落的形態(tài)、大小、顏色、質(zhì)地等特征，以及細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和運動特征等，初步確定菌種的類別。
生理生化特性測試：進(jìn)行一系列生理生化特性測試，包括碳源利用、氧氣需求、酸堿度耐受性、代謝產(chǎn)物等等，以進(jìn)一步確定菌種的特征和類別。
分子生物學(xué)鑒定：可以采用PCR、DNA測序等分子生物學(xué)技術(shù)對菌種進(jìn)行鑒定，通過比對菌株的16S rRNA序列和其他基因信息與數(shù)據(jù)庫中的菌株進(jìn)行比對，確定菌種的種屬、亞屬和菌株等信息。
確定菌株存儲方式：根據(jù)菌種的特性和存儲需求，選擇適當(dāng)?shù)木N保存方法進(jìn)行保存，如冷凍保存、干燥保存、液氮保存等等。
實驗室菌種鑒定是一個復(fù)雜的過程，需要多種方法和技術(shù)的綜合應(yīng)用。在進(jìn)行菌種鑒定之前，需要準(zhǔn)備充分，并建立完善的菌種鑒定流程和標(biāo)準(zhǔn)。
2、實驗室的無菌室管理水平
2.1無菌室內(nèi)物品要求
所有需入無菌室操作使用的培養(yǎng)基及緩沖液，包括：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液等，都必須經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌后，方可移入無菌室傳遞窗內(nèi)備用。所有需入無菌室操作使用的用具，器皿，包括：培養(yǎng)皿，剪刀，攝子，注射器，濾器，注射用水等，都必須經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌或高溫干熱滅菌后，方可移入無菌室傳遞窗內(nèi)備用。已洗滌的無菌衣，褲，帽，口罩均需裝入無菌袋后，經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌后，方可移入無菌室緩沖間內(nèi)備用。無菌檢驗用75%乙醇滅菌藥棉，無菌用酒精燈，無菌用盛水器及盛廢棄物容器等均需表面消毒入無菌室傳遞窗內(nèi)備用。
2.2無菌室消毒
按照GMP的要求每周一次應(yīng)對無菌室進(jìn)行大消毒，用消毒劑擦洗消毒，開啟紫外燈。擦拭方法：用無紡布浸漬消毒溶液清潔超凈臺的整個內(nèi)表面、頂面、及無菌室、人流、物流、緩沖間的地板、傳遞窗、門把手以及無菌室內(nèi)放置物品。清潔消毒程序應(yīng)從內(nèi)向外，從高潔凈區(qū)到低潔凈區(qū)。逐步向外退出潔凈區(qū)域。然后開啟無菌空氣過濾器及紫外燈殺菌1～2h，以殺滅殘留微生物。在每次操作前及操作后，同樣用上述消毒溶液擦拭工作臺面，并開啟紫外燈殺菌。無菌室內(nèi)拖鞋先用洗滌劑清潔，再用消毒劑浸泡30分鐘后，以備使用。
按照GMP的要求每周一次清潔回風(fēng)口的濾網(wǎng)：拆下回風(fēng)口的濾網(wǎng)，先用自來水沖洗，后用純化水沖洗，再用消毒液清洗消毒后安裝。每三個月一次用過氧化氫干霧對無菌室消毒（梅雨季節(jié)增加頻次），對無菌室進(jìn)行熏蒸，或無菌室環(huán)境發(fā)生異常情況時需熏蒸無菌室。熏蒸時應(yīng)關(guān)閉凈化系統(tǒng)，打開雙向連鎖門，用量為800ml過氧化氫，熏蒸45min，密閉4小時后，開啟凈化系統(tǒng)，使循環(huán)30分鐘后，用消毒劑擦洗無菌室。
2.3 微生物人員控制
除實驗室微生物組檢測員及本部門相關(guān)管理人員外，其他人員不得隨意進(jìn)入潔凈區(qū)。進(jìn)入潔凈區(qū)，操作人員必須進(jìn)入指定的房間，相鄰的房間不得隨意進(jìn)出。每個潔凈區(qū)實驗室內(nèi)不得超過3名工作人員。一旦潔凈區(qū)內(nèi)的機(jī)器發(fā)生故障需要維修人員進(jìn)入維修的，在不影響檢驗操作的情況下允許維修人員穿著無菌衣進(jìn)入，但不得超過2名。所有維修工器具需放在傳遞窗內(nèi)紫外燈下照射至少30分鐘。進(jìn)入無菌室操作時，必須對超凈臺內(nèi)的環(huán)境及工作區(qū)域進(jìn)行動態(tài)沉降菌監(jiān)測。在超凈臺的左、中、右各放胰酪大豆胨瓊脂平皿一個，工作區(qū)四個角及室中各放胰酪大豆胨瓊脂平皿一個，打開平皿蓋，暴露至無菌操作結(jié)束，蓋上碟蓋，倒置，同時編號。 操作結(jié)束后，操作人員須進(jìn)行指紋測試：打開含胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基的平皿，分別在二個碟子內(nèi)按上左右手各5個指紋，關(guān)閉平皿蓋，例置。取三個胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)皿，打開碟蓋，每碟粘取身上的無菌衣左臂、右臂及胸前任一個點，共取三個點，每點輕按5秒，然后閉蓋，平皿倒置收起。將所有沉降菌碟及接觸碟移入30～35℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)72小時. 一個操作者的無菌衣的三個取樣點菌落數(shù)之和≤10cfu。一個操作者的手指菌每只手≤3cfu。
2.4 AI在微生物限度和無菌操作中的應(yīng)用
目前先進(jìn)的制藥企業(yè)已可以通過AI技術(shù)對更衣確認(rèn)過程進(jìn)行精準(zhǔn)控制和比對。
人工智能（AI）在無菌操作中可以應(yīng)用于以下幾個方面：
無菌環(huán)境的監(jiān)測：通過安裝傳感器和監(jiān)測設(shè)備，可以收集環(huán)境參數(shù)數(shù)據(jù)，如溫度、濕度、氣壓、氣體濃度等，并利用AI技術(shù)分析這些數(shù)據(jù)，實現(xiàn)對無菌操作環(huán)境的實時監(jiān)測和控制。
無菌操作過程中的自動化控制：利用機(jī)器學(xué)習(xí)和深度學(xué)習(xí)等AI技術(shù)，對無菌操作中的自動化設(shè)備進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，實現(xiàn)無菌操作的自動化控制。例如，使用機(jī)器人進(jìn)行樣品處理、實驗操作、無菌包裝等。
污染源追蹤和預(yù)警：利用AI技術(shù)，分析和識別無菌操作環(huán)境中的污染源，如微生物、異物等，并進(jìn)行預(yù)警和管理。例如，通過機(jī)器視覺技術(shù)，對無菌操作環(huán)境中的微生物進(jìn)行實時檢測和識別。
無菌操作過程中的數(shù)據(jù)管理和分析：利用AI技術(shù)，對無菌操作過程中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行管理和分析，以提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量。例如，通過機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)，對生產(chǎn)過程中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和預(yù)測，實現(xiàn)生產(chǎn)流程的優(yōu)化和改進(jìn)。
總之，AI技術(shù)在無菌和微生物操作方面的應(yīng)用可以幫助企業(yè)實現(xiàn)無菌操作的自動化、智能化和數(shù)據(jù)化管理，提高產(chǎn)品質(zhì)量。在AI系統(tǒng)完善方面根據(jù)用戶實際情況和異常記錄，調(diào)整檢測邏輯，統(tǒng)計哪些情況不經(jīng)常發(fā)生，哪些情況容易誤報，哪些情況沒必要頻繁檢測等。
在AI模型更新方面利用新積累的數(shù)據(jù)，訓(xùn)練提升模型精度，更新模型。
3、調(diào)查過程具體情況分析
3.1調(diào)查中發(fā)現(xiàn)直接導(dǎo)致偏差的明確根本原因。
例如未按照SOP執(zhí)行造成的污染、在取樣或檢驗過程中使用了較差的無菌技術(shù)、已識別的實驗室錯誤、或使用了非無菌檢驗材料。分離菌的鑒別和來自檢驗環(huán)境相同的污染之間可能有直接聯(lián)系。這些情況下，檢驗可認(rèn)為無效。如果檢驗無效，階段I調(diào)查會在不進(jìn)入階段II生產(chǎn)調(diào)查的情況下得出結(jié)論。后續(xù)糾正無效的原始原因。
3.2 調(diào)查可能揭示了一些問題，但沒有足夠證據(jù)將調(diào)查結(jié)果與偏差直接關(guān)聯(lián)。
例如，如果檢驗期間的環(huán)境監(jiān)測顯示有微生物，但菌種鑒定結(jié)果與樣本中的污染物不同種屬，實驗室調(diào)查將被認(rèn)定為不確定性的，沒有提供足夠的證據(jù)使結(jié)果無效，調(diào)查將進(jìn)入階段II生產(chǎn)調(diào)查。
3.3調(diào)查結(jié)果沒有顯示任何實驗室檢驗異常。
整個OOS調(diào)查過程清楚地證明所有標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程都遵循了，檢驗員具有適當(dāng)?shù)馁Y質(zhì)進(jìn)行檢驗，所有材料、設(shè)備和檢驗環(huán)境認(rèn)為是可信的。報告數(shù)據(jù)和所有最終結(jié)果的計算都是正確且得到確認(rèn)的。因此，偏差被確認(rèn)并被認(rèn)為是有效的，所以調(diào)查必須進(jìn)行到階段II，以確定生產(chǎn)過程中使用的工藝污染源。一旦通過階段I調(diào)查過程實驗室錯誤被排除或不確定，調(diào)查的重點則是生產(chǎn)設(shè)施、人員、工藝和物料。
以上經(jīng)驗可以幫助實驗室對微生物數(shù)據(jù)偏差進(jìn)行系統(tǒng)性調(diào)查和解決，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和合規(guī)性。在實驗室中，還應(yīng)該建立完善的質(zhì)量管理體系和質(zhì)量控制程序，對微生物檢測過程進(jìn)行規(guī)范化管理和監(jiān)控。如果微生物檢驗結(jié)果超限或超標(biāo)的根本原因不能確定，必須提出最可能的原因。對超趨勢結(jié)果進(jìn)行調(diào)查可能有助于在其發(fā)展為超標(biāo)結(jié)果之前識別實驗室和/或生產(chǎn)問題。為了防止這些微生物失敗的再次發(fā)生，后續(xù)必須執(zhí)行CAPA計劃，明確負(fù)責(zé)人將CAPA計劃的進(jìn)展報告給質(zhì)量控制部門及其管理人員，CAPA執(zhí)行后由實驗室的QA人員對CAPA的后續(xù)有效性進(jìn)行定期跟蹤。
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