剛剛，國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心發(fā)布《乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則（2023年修訂版征求意見稿）》，內(nèi)容如下：
乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑注冊審查指導(dǎo)原則
（2023年修訂版征求意見稿）
本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）基因分型檢測試劑注冊申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評部門對注冊申報(bào)資料的技術(shù)審評提供參考。
本指導(dǎo)原則是對乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。
本指導(dǎo)原則是供注冊申請人和技術(shù)審評人員使用的指導(dǎo)性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項(xiàng)，亦不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。
本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。
一、適用范圍
本指導(dǎo)原則適用于采用實(shí)時(shí)熒光 PCR法，對人血清、血漿樣本中的乙型肝炎病毒進(jìn)行基因分型的檢測試劑。
對于采用其他分子生物學(xué)方法或其他樣本類型的乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑，可能部分要求不完全適用或本文所述內(nèi)容不夠全面，申請人可參照本指導(dǎo)原則，根據(jù)產(chǎn)品特性對適用部分進(jìn)行評價(jià)，并補(bǔ)充其他的評價(jià)資料。
HBV 屬嗜肝DNA 病毒科，基因組長約3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。根據(jù)全基因組序列差異>8%或S基因序列差異>4%的標(biāo)準(zhǔn)，可將其分為不同的基因型。目前HBV至少有9 種（A 型至I 型）基因型和1 種未定基因型（J 型）。
不同基因型的HBV 在耐藥性、致病力及基因突變頻率等方面存在一定差別，導(dǎo)致不同基因型HBV 感染者的疾病嚴(yán)重程度、藥物治療反應(yīng)和最終結(jié)局不同。因此在確認(rèn)HBV感染后立即進(jìn)行基因型檢測有助于指導(dǎo)臨床選擇用藥。
本指導(dǎo)原則適用于乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑注冊申請和變更注冊申請的情形。本指導(dǎo)原則僅針對乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑注冊申報(bào)資料中的部分內(nèi)容進(jìn)行撰寫，其他未盡事宜應(yīng)當(dāng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》等相關(guān)法規(guī)要求。
二、注冊審查要點(diǎn)
（一）監(jiān)管信息
1. 產(chǎn)品名稱及分類編碼
產(chǎn)品名稱應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》及相關(guān)法規(guī)的要求，如乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒（熒光PCR法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。
2. 其他信息還包括產(chǎn)品列表、關(guān)聯(lián)文件、申報(bào)前與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的聯(lián)系情況和溝通記錄以及符合性聲明等文件。
（二）綜述資料
綜述資料主要包括概述、產(chǎn)品描述、預(yù)期用途、申報(bào)產(chǎn)品上市歷史及其他需說明的內(nèi)容。應(yīng)詳細(xì)說明產(chǎn)品所采用的技術(shù)原理及檢測流程。提供不同適用機(jī)型的檢測通量，即一次檢測最多可檢測的樣本數(shù)。提供核酸提取（手工和自動提取方式應(yīng)分別明確）和PCR擴(kuò)增的時(shí)間，以及檢測全過程所需的時(shí)間。不同檢測流程，分別提供最少和最多檢測樣本量下的檢測時(shí)間。與已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比較應(yīng)著重從方法學(xué)及不同基因型檢出能力等方面寫明擬申報(bào)產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別，比較內(nèi)容包括樣本類型，檢測原理，檢測靶基因，組成成分，內(nèi)標(biāo)，質(zhì)控品，判讀規(guī)則，分析性能和臨床性能等。
（三）非臨床資料
1. 產(chǎn)品技術(shù)要求及檢驗(yàn)報(bào)告
注冊申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、前期評價(jià)等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)資料，結(jié)合產(chǎn)品特性按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的要求編寫。該類產(chǎn)品作為第三類體外診斷試劑，應(yīng)當(dāng)以附錄形式明確主要原材料以及生產(chǎn)工藝要求。
B型、C型乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑已有國家參考品，技術(shù)要求中應(yīng)體現(xiàn)國家參考品的相關(guān)要求，并使用國家參考品對三批產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)。
如果有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品技術(shù)要求的相關(guān)要求應(yīng)不低于相應(yīng)的要求。
2. 分析性能研究
注冊申請人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行所有分析性能研究，提交具體研究方法、試驗(yàn)方案、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。
分析性能評估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來源、樣本類型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過程及數(shù)據(jù)等。分析性能評估用樣本一般應(yīng)為真實(shí)樣本或病毒培養(yǎng)物，如涉及稀釋后檢測，應(yīng)采用與適用樣本類型一致的陰性基質(zhì)。不可采用質(zhì)?；蚣俨《具M(jìn)行分析性能評估。對于各項(xiàng)性能中采用的樣本，在下述各項(xiàng)性能研究資料中分別提供樣本信息列表。
2.1樣本穩(wěn)定性
樣本穩(wěn)定性研究包括采集后未經(jīng)處理的樣本，核酸提取純化后的DNA樣本，研究內(nèi)容包括冷藏保存時(shí)間，冷凍保存時(shí)間，凍融次數(shù)等。
2.2適用的樣本類型
列明產(chǎn)品適用的樣本類型。
2.3準(zhǔn)確度
采用申報(bào)試劑與臨床診斷或已上市產(chǎn)品，同時(shí)檢測臨床樣本，比較檢測結(jié)果之間的一致性程度，進(jìn)行申報(bào)試劑的準(zhǔn)確度評價(jià)。
樣本應(yīng)選擇符合樣本穩(wěn)定性的預(yù)期人群樣本。研究應(yīng)納入一定數(shù)量的陰性和陽性樣本，應(yīng)覆蓋常見的基因型別并注意包含一定數(shù)量的陽性判斷值附近的樣本和干擾樣本。
2.4企業(yè)參考品驗(yàn)證
根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)并提供詳細(xì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
所有基因型別的陽性參考品均應(yīng)按要求檢出陽性，考慮到濃度梯度的不同，應(yīng)對各水平陽性參考品設(shè)置相應(yīng)Ct值的限制；陰性參考品應(yīng)按要求檢出為陰性。
2.5精密度
應(yīng)對精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運(yùn)行、時(shí)間、操作者、儀器、試劑批次和地點(diǎn)等影響精密度的條件，設(shè)計(jì)合理的精密度試驗(yàn)方案進(jìn)行評價(jià)。
精密度評價(jià)試驗(yàn)應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評價(jià)周期。
應(yīng)采用臨床樣本進(jìn)行精密度評價(jià)，應(yīng)至少包含3個(gè)水平：陰性樣本、檢測限水平樣本、中/強(qiáng)陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫螅纾?/span>
陰性樣本：不含待測物或待測物濃度為零時(shí)，陰性符合率應(yīng)為100%（n≥20）。
檢測限水平樣本：檢出限水平樣本陽性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。
中/強(qiáng)陽性樣本：待測物濃度呈中度到強(qiáng)陽性，陽性符合率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。
2.6檢測限
2.6.1檢測限的確定
建議將不同來源的至少3例乙型肝炎病毒樣本分別梯度稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進(jìn)行檢出限的確定。每個(gè)濃度梯度重復(fù)檢測不少于21次，將具有95%陽性檢出率的濃度水平作為檢出限。
在進(jìn)行檢測限建立時(shí)申請人應(yīng)對申報(bào)產(chǎn)品聲稱可檢測的乙型肝炎病毒的不同基因型分別進(jìn)行研究。
2.6.2檢測限的驗(yàn)證
另外選擇具有時(shí)間和區(qū)域特征性的至少3個(gè)臨床樣本或病毒培養(yǎng)物在檢出限濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)達(dá)到95%陽性檢出率。
申請人應(yīng)對申報(bào)產(chǎn)品聲稱可檢測的乙型肝炎病毒的不同基因型的檢出限分別進(jìn)行驗(yàn)證。
應(yīng)提供詳細(xì)的病毒滴度/濃度的確定方法，同時(shí)應(yīng)詳細(xì)描述病毒樣本的確認(rèn)方法及驗(yàn)證結(jié)果。
2.7基因混合型的研究
該部分研究主要包括兩個(gè)目的：一是申報(bào)試劑檢測不同濃度混合型的能力。申請人應(yīng)設(shè)置不同濃度比例的混合型進(jìn)行驗(yàn)證。二是申報(bào)試劑在判讀結(jié)果時(shí)，是否能夠有效區(qū)分基因重組型和基因混合型。申請人應(yīng)設(shè)置不同濃度的基因重組型與不同混合比例的基因混合型進(jìn)行驗(yàn)證。
因理想的不同濃度比例基因混合型樣本在臨床單位中難以收集，申請人可以使用臨床模擬樣本進(jìn)行驗(yàn)證。該部分樣本建議用核酸測序明確樣本中包含的所有基因型序列，同時(shí)應(yīng)使用核酸定量的方法確定不同基因型的濃度。
如申報(bào)產(chǎn)品的結(jié)果判讀無法有效區(qū)分基因混合型與基因重組型，應(yīng)在產(chǎn)品說明書中進(jìn)行注明。
2.8分析特異性
2.8.1交叉反應(yīng)
用于乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體種類主要考慮以下幾方面：
核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體。
申報(bào)產(chǎn)品中不同基因型以及乙型肝炎病毒其他基因型對被檢測基因型的影響。對于難以獲得的基因型, 可采用針對該基因型構(gòu)建的質(zhì)?；蚱渌蚬こ坍a(chǎn)品進(jìn)行交叉驗(yàn)證。
建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平對乙型肝炎病毒核酸陰性樣本進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。通常，細(xì)菌感染的水平為106 cfu/ml或更高，病毒為105 pfu/ml或更高。
申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗(yàn)證的信息應(yīng)在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標(biāo)】項(xiàng)中有所體現(xiàn)。
表1 推薦用于交叉反應(yīng)性研究的微生物
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甲型肝炎病毒 |
丙型肝炎病毒 |
人類免疫缺陷病毒 |
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梅毒 |
人巨細(xì)胞病毒 |
EB病毒 |
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單純皰疹病毒1型 |
單純皰疹病毒2型 |
水痘帶狀皰疹病毒 |
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人類皰疹病毒6型 |
甲型流感病毒 |
梅毒螺旋體 |
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白色念珠菌 |
金黃色葡萄球菌 |
光滑念珠菌 |
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百日咳桿菌 |
奈瑟氏菌屬 |
結(jié)核分枝桿菌 |
2.8.2微生物干擾
申請人應(yīng)充分考慮臨床上容易與乙型肝炎病毒合并感染的病原體以及不同基因型的乙型肝炎病毒，在高濃度的情況下對低濃度（例如檢出限濃度）被測基因型乙型肝炎病毒檢測的影響。
2.8.3競爭性干擾
申請人應(yīng)充分考慮臨床上常見存在的乙型肝炎病毒不同基因型混合感染情況，評價(jià)高濃度分析物對低濃度分析物檢測的影響。建議申請人結(jié)合申報(bào)試劑的反應(yīng)模式，使用一種基因型最低檢測限濃度的乙型肝炎病毒和另一種基因型高濃度乙型肝炎病毒評估競爭性干擾，競爭性感染的乙型肝炎病毒基因型別組合建議為同一反應(yīng)體系內(nèi)常見不同基因型混合感染的乙型肝炎病毒。競爭性干擾試驗(yàn)可與最低檢測限、重復(fù)性或其他干擾試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。
2.8.4干擾物質(zhì)
應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進(jìn)行驗(yàn)證。
內(nèi)源性干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，如血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素等。
外源性干擾物質(zhì)：常用抗凝劑，臨床常用抗病毒藥物如：干擾素、拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋、替比夫定等對檢測結(jié)果的影響。
建議在病毒的檢測限附近水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進(jìn)行檢測。干擾物濃度的分布應(yīng)覆蓋人體生理及病理狀態(tài)下可能出現(xiàn)的物質(zhì)濃度。應(yīng)注明不同干擾物質(zhì)對被檢測物質(zhì)無干擾的最高限值。對于不易收集的干擾物質(zhì)濃度樣本可使用臨床模擬樣本進(jìn)行調(diào)節(jié)。
2.9核酸提取/純化性能
在進(jìn)行核酸檢測之前，建議有核酸提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的DNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，必要時(shí)可考慮與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進(jìn)行抗干擾、精密度和檢出限的驗(yàn)證。
2.10反應(yīng)體系
2.10.1 基因位點(diǎn)選擇、方法學(xué)介紹。
2.10.2核酸提取和反應(yīng)體系
研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下盡量擴(kuò)大總反應(yīng)體系和加樣量，以提高檢測靈敏度。
提交不同適用機(jī)型基線和閾值循環(huán)數(shù)的確定資料。
不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述，并提交驗(yàn)證資料。
3. 穩(wěn)定性研究
申報(bào)試劑的穩(wěn)定性主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性、機(jī)載穩(wěn)定性（如適用）及凍融次數(shù)限制等，申請人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。
4. 陽性判斷值研究
陽性判斷值研究用樣本來源應(yīng)具有多樣性和代表性，考慮不同年齡、地域、型別等因素，盡量納入含有干擾物質(zhì)或其他易引起交叉反應(yīng)病原體的樣本。建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對申報(bào)產(chǎn)品進(jìn)行陽性判斷值研究。如存在判定值灰區(qū)，應(yīng)提供灰區(qū)的確認(rèn)資料。如采用其他方法對陽性判斷值進(jìn)行確認(rèn)研究，應(yīng)說明這種方法的合理性。提供內(nèi)標(biāo)值的確定方法和研究資料。對于此類試劑，正常人群及其他患病人群中一般不應(yīng)檢出HBV基因型。
如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，需要對各樣本類型進(jìn)行陽性判斷值的驗(yàn)證。
提交陽性判斷值研究所用樣本的背景信息列表，至少包括性別、年齡、臨床診斷信息、樣本來源機(jī)構(gòu)、檢測結(jié)果等信息。
5. 其他資料
5.1主要原材料研究資料
該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料、質(zhì)控品的定值試驗(yàn)資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)提供其詳細(xì)制備過程；如主要原材料源于外購，應(yīng)提供資料包括：選擇該原材料的依據(jù)及對比篩選試驗(yàn)資料、生產(chǎn)商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗(yàn)報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。生產(chǎn)商應(yīng)固定，不得隨意更換。
5.1.1引物和探針：應(yīng)詳述引物和探針的設(shè)計(jì)原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點(diǎn)及兩者的對應(yīng)情況。建議每種基因型的病毒設(shè)計(jì)兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和功能性試驗(yàn)等方式，對病毒進(jìn)行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評價(jià)，其中序列比對包括與已公布乙型肝炎病毒序列的比對，及與易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的序列比對；功能性試驗(yàn)包括對不同來源、不同滴度/濃度的乙型肝炎病毒不同基因型別陽性樣本，和不同的近緣病原體的檢測。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性試驗(yàn)等。
5.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應(yīng)提供對其純度、濃度、功能性等詳細(xì)驗(yàn)證資料。
5.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、功能性等進(jìn)行評價(jià)和驗(yàn)證。
5.1.4質(zhì)控品
試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。陽性質(zhì)控品應(yīng)包含試劑盒檢測的靶序列，可采用質(zhì)粒、假病毒等制備。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個(gè)提取和PCR擴(kuò)增過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。提交試劑盒質(zhì)控品有關(guān)原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗(yàn)資料，對質(zhì)控品的檢測結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。
5.1.5內(nèi)標(biāo)
內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對照，可對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴(kuò)增。申請人需對內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計(jì)和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果Ct值范圍。
5.1.6企業(yè)參考品
該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品和精密度參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗(yàn)證的實(shí)際需要設(shè)置企業(yè)參考品。
應(yīng)提交企業(yè)參考品的原料來源、選擇、制備、陰陽性及濃度確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)驗(yàn)證資料。企業(yè)參考品建議采用滅活病毒的臨床樣本。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：
陽性參考品：陽性參考品應(yīng)包含試劑盒所能檢測的所有基因型（所有的單基因型以及所有的重組基因型），每個(gè)基因型應(yīng)設(shè)置不同濃度水平，應(yīng)能滿足驗(yàn)證產(chǎn)品性能的需要，至少設(shè)置兩個(gè)濃度水平（弱陽性、中或強(qiáng)陽性）；常見基因型（如B型、C型）陽性參考品設(shè)置建議采用滅活病毒的血清/血漿。其他基因型陽性參考品設(shè)置可采用模擬臨床樣本。對于陽性參考品的獲取方式建議使用金標(biāo)準(zhǔn)的方法或同類方法或者其他能證明問題的方法進(jìn)行確認(rèn)。
陰性參考品：可采用經(jīng)確認(rèn)無目標(biāo)靶基因的序列的樣本。陰性參考品可反映非特異擴(kuò)增或檢測過程，當(dāng)不存在目標(biāo)序列時(shí)不會得到相關(guān)信號。陰性參考品設(shè)置建議采用滅活的血清/血漿。
檢出限參考品：可采用95%陽性檢出水平或略高于檢測限的水平，如100%陽性檢出水平。應(yīng)針對申報(bào)產(chǎn)品聲稱可檢出的所有基因型乙型肝炎病毒分別設(shè)置。
精密度參考品：建議包括高、低兩個(gè)濃度的樣本，其中一個(gè)濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。應(yīng)針對申報(bào)產(chǎn)品聲稱可檢出的所有基因型乙型肝炎病毒分別設(shè)置。
5.2生產(chǎn)工藝研究資料
介紹產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝，可用流程圖結(jié)合文字的方式表述。提交主要生產(chǎn)工藝的確定及優(yōu)化研究資料。
（四）臨床評價(jià)資料
1.試驗(yàn)方法
乙型肝炎病毒基因分型核酸檢測試劑目前主要供臨床醫(yī)護(hù)人員對慢性乙型肝炎患者設(shè)置臨床治療方案提供參考依據(jù)。隨著乙型肝炎基因型與肝炎病情關(guān)系的研究工作不斷深入，研究方法不斷改進(jìn)，新的研究成果可能將被轉(zhuǎn)化應(yīng)用于臨床工作中。如乙型肝炎病毒基因分型核酸檢測試劑用于新的臨床用途，應(yīng)根據(jù)新的臨床用途特點(diǎn)設(shè)置具有針對性的臨床試驗(yàn)研究方案。
參比方法的選擇可以考慮以下幾方面：
1.1 如已有同類產(chǎn)品上市，應(yīng)選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為參比試劑，采用擬申報(bào)產(chǎn)品（以下稱試驗(yàn)體外診斷試劑）與之進(jìn)行對比試驗(yàn)研究，評價(jià)試驗(yàn)體外診斷試劑與已上市同類試劑之間的一致性。應(yīng)充分考慮已上市同類試劑的型別選擇、靶序列選擇、分析靈敏度等特性，確保對比試劑與申報(bào)試劑具有明確可比性。
1.2 如無已上市同類產(chǎn)品，申請人可采用核酸序列測定方法作為此類試劑臨床試驗(yàn)研究的對比方法，驗(yàn)證試驗(yàn)體外診斷試劑檢測結(jié)果與核酸序列測定（測序）結(jié)果之間的一致性情況。臨床試驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)對選用的測序方法做詳細(xì)介紹。
申請人應(yīng)提供以下關(guān)于測序部分的詳細(xì)試驗(yàn)資料，需有臨床試驗(yàn)單位簽章確認(rèn)：
1.2.1 測序方法原理、測序儀型號、測序試劑及消耗品的相關(guān)信息。
1.2.2 測序方法所用引物相關(guān)信息，如基因區(qū)段選擇，分子量、純度、功能性實(shí)驗(yàn)等資料。引物設(shè)計(jì)應(yīng)合理涵蓋考核試劑擴(kuò)增的靶核酸區(qū)段、位點(diǎn)、及所有突變類型。
1.2.3 對所選測序方法的分析性能進(jìn)行合理驗(yàn)證，尤其是最低檢測限的確認(rèn)，建議將所選測序方法與申報(bào)試劑的相關(guān)性能進(jìn)行適當(dāng)比對分析。
1.2.4 測序方法應(yīng)建立合理的陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品對臨床樣本的檢測結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。
1.2.5 提交有代表性的樣本測序圖譜及結(jié)果分析資料。
2.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇
應(yīng)選擇不少于3家（含3家）已備案的臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照相關(guān)法規(guī)、指導(dǎo)原則的要求開展臨床試驗(yàn)。建議申請人在選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)時(shí)，應(yīng)考慮試驗(yàn)機(jī)構(gòu)之間的地域代表性，臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)應(yīng)具有分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實(shí)驗(yàn)操作人員應(yīng)有足夠的時(shí)間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價(jià)方案。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，試驗(yàn)體外診斷試劑和對比試劑都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性。
3.臨床試驗(yàn)方案
臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的方案。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動。整個(gè)試驗(yàn)過程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉試驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。
試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的病例納入/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案，并明確說明原因。在試驗(yàn)操作過程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。
4.臨床試驗(yàn)對象選擇
4.1基因型方面的考慮
HBV病毒為DNA病毒，其基因具有顯著的多樣性，不同的地區(qū)和民族，HBV流行的基因型不同。境內(nèi)流行的HBV基因型主要為B型、C型，部分地區(qū)存在少數(shù)D 型，以及重組型基因B/C型，B/D型，C/D型等。而且，HBV基因型具有一定的地域差異，不同地區(qū)流行的HBV基因型也不盡相同。因此，在選擇HBV感染者病例時(shí)，首先應(yīng)根據(jù)HBV流行的情況，選擇能代表我國不同地區(qū)流行基因型的HBV感染者病例，以對試劑檢測我國流行的HBV病毒的能力進(jìn)行客觀科學(xué)的評價(jià)，選擇的基因型應(yīng)包括上述三種主要的基因型。
4.2病例選擇及樣本量
臨床試驗(yàn)的入組病例應(yīng)以確診的慢性乙型肝炎病毒感染者為主，涵蓋注冊申報(bào)試劑所聲稱的所有基因型。對于B型及C型基因型臨床樣本，建議每種基因型不少于200例臨床樣本；對于D型基因型及其他基因型臨床樣本，建議每種不少于30例陽性病例。每種基因型臨床樣本應(yīng)來源于乙型肝炎病毒核酸檢測陽性的患者。如注冊申報(bào)試劑中包含其他基因型，應(yīng)結(jié)合這部分基因型在我國的流行病學(xué)特點(diǎn)，臨床應(yīng)用情況等綜合因素，對其臨床有效性進(jìn)行科學(xué)評估。
在樣本選擇時(shí)，應(yīng)注重患者來源的不同地域性，不同病情進(jìn)展，不同藥物治療方案等。同時(shí)應(yīng)選擇部分干擾樣本（交叉反應(yīng)樣本），對于干擾樣本的選擇，應(yīng)考慮到在檢測過程中容易產(chǎn)生干擾，可能造成假陽性/假陰性的情況，以從臨床角度考察其分析特異性。
5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
對臨床試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，對于申報(bào)產(chǎn)品與對比方法的一致性評價(jià)，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種方法的結(jié)果，評價(jià)指標(biāo)一般包括陽性符合率/靈敏度、陰性符合率/特異度，Kappa值等，并計(jì)算相應(yīng)的95%置信區(qū)間。
6.結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證
在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑的檢測結(jié)果有不一致的樣本，如有必要，應(yīng)采用臨床上公認(rèn)較好的第三種同類試劑或參考方法對結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，同時(shí)結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可
能結(jié)果進(jìn)行分析。
7.臨床試驗(yàn)總結(jié)報(bào)告撰寫
根據(jù)《醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)質(zhì)量管理規(guī)范》（2022年第28號）、《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》（2021年第72號）的要求，撰寫臨床試驗(yàn)小結(jié)與報(bào)告，并且滿足簽章等要求。臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)該對試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。
（五）產(chǎn)品說明書和標(biāo)簽樣稿
產(chǎn)品說明書格式應(yīng)滿足《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求。產(chǎn)品說明書中技術(shù)內(nèi)容應(yīng)與注冊申報(bào)資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，應(yīng)以規(guī)范格式進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。乙型肝炎病毒基因分型檢測試劑說明書編寫應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注以下內(nèi)容。
1.【預(yù)期用途】
1.1試劑盒用于體外定性檢測已明確為乙型肝炎病毒核酸陽性患者的血清、血漿等樣本中乙型肝炎病毒基因型。輔助醫(yī)療專業(yè)人員了解病人的乙型肝炎病毒基因型感染情況以及確定適當(dāng)?shù)闹委煼椒ā?/span>
1.2 乙型肝炎病毒基因分型試劑的基因型應(yīng)至少包括B型、C型、D型，如果申請人略去上述任意一種推薦的基因型，應(yīng)給出合理的解釋。
1.3 適用人群：確診的慢性乙型肝炎病毒感染者。
1.4 簡要介紹乙型肝炎病毒基因型的特征，包括不同基因型的特征、不同基因型常見亞型、不同基因型在地域及人群中的分布情況、不同基因型在臨床的應(yīng)用特點(diǎn)。
1.5 強(qiáng)調(diào)該試劑盒檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為治療藥物調(diào)整的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情及其他實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)等因素對患者治療進(jìn)行綜合判斷。
2.【檢驗(yàn)原理】
2.1 對試劑盒檢測能夠覆蓋的所有被檢測的基因型進(jìn)行詳細(xì)描述（靶序列長度及來源區(qū)段、基因型類型及相關(guān)特征等），對引物及探針設(shè)計(jì)簡介、不同樣品反應(yīng)管組合、對照品設(shè)置及熒光信號檢測原理等進(jìn)行逐項(xiàng)介紹。
2.2 核酸提取純化的方法、原理等。
2.3 試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如UNG酶），也應(yīng)對其作用機(jī)理作適當(dāng)介紹。
3.【主要組成成分】
明確試劑盒中各組分及具體成分。明確需要但未提供的材料，例如核酸提取試劑等的產(chǎn)品名稱，生產(chǎn)廠家，貨號及注冊證號、備案號等信息。
4.【適用機(jī)型】
注明所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。
5.【儲存條件及有效期】
試劑盒的效期穩(wěn)定性等，明確具體的儲存條件及有效期等信息。
6.【樣本要求】
6.1 樣本收集要求：如采集時(shí)間、采集順序等，是否受臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。結(jié)合臨床需要并參照慢性乙型肝炎防治指南（現(xiàn)行版）相關(guān)要求。
6.2 血液樣本應(yīng)當(dāng)說明對采血管及抗凝劑的要求：明確樣本類型、采血管和抗凝劑，其他樣本應(yīng)說明樣本采集、處理及保存方式。
6.3 樣本處理、運(yùn)送及保存：對血液樣本離心條件的要求，核酸提取前的預(yù)處理、運(yùn)送條件、保存條件及期限（短期、長期）等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的要求。如有需要應(yīng)對高于檢測范圍的樣本稀釋方法進(jìn)行規(guī)定。
7.【檢驗(yàn)方法】
詳細(xì)說明試驗(yàn)操作的各個(gè)步驟：
7.1 試劑準(zhǔn)備及配制方法、注意事項(xiàng)。
7.2 詳述待測樣本、質(zhì)控品核酸提取的條件、步驟及注意事項(xiàng)。
7.3 核酸提取/純化方法的詳細(xì)介紹。
7.4 擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。
7.5 PCR各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)設(shè)置及相關(guān)注意事項(xiàng)。
7.6 儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標(biāo)記情況對待測基因及內(nèi)標(biāo)的熒光通道選擇。
7.7 基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法。
8.【陽性判斷值或者參考區(qū)間】
該類產(chǎn)品用于定性檢測，Cut-off值是檢測試劑有效區(qū)分檢測結(jié)果陽性和陰性的標(biāo)準(zhǔn)，如產(chǎn)品檢測原理為熒光PCR法。Cut-off的描述包括基線的確定方法和循環(huán)閾值（Ct值）的要求。除Ct值要求外，對于接近Cut-off值的弱陽性結(jié)果或者接近Cut-off值的陰性結(jié)果建議結(jié)合擴(kuò)增結(jié)果的S形曲線對結(jié)果進(jìn)行判斷。
9.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
結(jié)合陽性對照、陰性對照以及反應(yīng)管中靶基因和內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果（Ct值），對所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述。如存在檢測灰區(qū)，應(yīng)對灰區(qū)結(jié)果的處理方式一并詳述。建議將不同結(jié)果的典型性圖譜納入說明書中，便于用戶對結(jié)果的讀取。
10.【檢驗(yàn)方法的局限性】
10.1 該產(chǎn)品僅用于乙型肝炎病毒核酸檢測陽性患者的臨床樣本檢測。
10.2 該產(chǎn)品僅用于不同基因型的定性檢測，不適用定量檢測。
10.3該產(chǎn)品未包含全部乙型基因型別。該產(chǎn)品僅用于產(chǎn)品說明書預(yù)期用途所包含的已知基因型的檢測，不適用其他基因型及未知基因型的檢測。因此，當(dāng)本試劑盒檢測結(jié)果為陰性時(shí)，并不能排除被檢測者帶有乙型肝炎病毒的其他基因位點(diǎn)。
10.4 如申報(bào)產(chǎn)品因產(chǎn)品原理導(dǎo)致無法對乙型肝炎病毒不同基因型混合樣本和重組型樣本進(jìn)行區(qū)別，應(yīng)在產(chǎn)品說明書中進(jìn)行注釋，幫助醫(yī)療專業(yè)人員對檢測結(jié)果進(jìn)行客觀認(rèn)識。
10.5 模板DNA 質(zhì)量將影響該產(chǎn)品檢測結(jié)果。模板DNA 的質(zhì)量可能受樣本來源、采集過程、運(yùn)輸條件、樣本處理等因素影響，同時(shí)也受DNA提取方法、PCR 儀類型、操作環(huán)境以及當(dāng)前分子生物學(xué)技術(shù)的局限性等的限制，可能導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性和假陰性的檢測結(jié)果。使用者須了解檢測過程中可能存在的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
10.6 該產(chǎn)品以乙型肝炎病毒基因上的特定DNA 片段為檢測靶標(biāo)，如試劑盒引物與探針結(jié)合區(qū)出現(xiàn)基因突變，導(dǎo)致檢測結(jié)果異常，將影響檢測結(jié)果解釋。
11.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】
詳述以下性能指標(biāo)：
11.1最低檢出限：說明試劑不同樣本類型及不同基因型的最低檢出限，簡要介紹最低檢出限的確定方法以及對最低檢出限驗(yàn)證所采用的基因型。如不同基因型之間最低檢出限不同，應(yīng)分別列出。
11.2 精密度/重復(fù)性：精密度參考品的組分、濃度及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)、評價(jià)結(jié)果。
11.3 特異性：
11.3.1交叉反應(yīng)：
易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體以及乙型肝炎病毒其他基因型的驗(yàn)證情況，建議以列表的方式表示經(jīng)過交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體名稱、型別、濃度等信息。
11.3.2干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。
11.3.3藥物影響：常用抗病毒藥物、干擾素等對檢測結(jié)果的影響，如未進(jìn)行相關(guān)研究也應(yīng)提供相關(guān)警示說明。
11.3.4對比試驗(yàn)研究（如有）：簡要介紹對比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。
12.【注意事項(xiàng)】
應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：
12.1 如該產(chǎn)品含有人源或動物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在
感染性的警告。
12.2 臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。
三、參考文獻(xiàn)：
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[2]《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》 （國家藥品監(jiān)督管理局公告2021年第122號）[Z].
[3]《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》 （國藥監(jiān)局2021年第72號）[Z].
[4]《定性檢測體外診斷試劑分析性能評估注冊審查指導(dǎo)原則》 （國家藥監(jiān)局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心2022年第36號）[Z].
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