實(shí)驗(yàn)室常用的分子診斷技術(shù)包括：PCR、Sanger 測(cè)序、二代基因測(cè)序(NGS)、原位雜交等，鑒于實(shí)際臨床工作中進(jìn)行分子診斷的樣本類型（如進(jìn)行原位雜交的樣本有血液、羊 水穿刺、腫瘤組織等）以及預(yù)期用途差別較大，而不同樣本類型對(duì)性能驗(yàn)證的要求和難易程 度差別較大，建議結(jié)合實(shí)際情況酌情選擇與之相符合的性能驗(yàn)證方案。
目前，實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展的分子診斷項(xiàng)目以PCR技術(shù)最為常用，PCR技術(shù)又分為PCR定量檢測(cè)技術(shù)和PCR定性檢測(cè)技術(shù)。本文依據(jù)CNAS整理出采用PCR技術(shù)的分子診斷項(xiàng)目宜參考的性能驗(yàn)證參數(shù)及方案。
一、PCR定性檢測(cè)項(xiàng)目
（一）性能驗(yàn)證參數(shù)
1. PCR 定性檢測(cè)選擇驗(yàn)證的性能指標(biāo)宜包括方法符合率、檢出限、抗干
擾能力、交叉反應(yīng)等。
2. 如果檢驗(yàn)程序適用樣本類型包括血清與血漿，實(shí)驗(yàn)室在臨床檢測(cè)時(shí)同時(shí)使用 血清與血漿，應(yīng)進(jìn)行血清與血漿結(jié)果一致性的驗(yàn)證。
3. 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的預(yù)期用途以及生產(chǎn)制造商聲明，選擇對(duì)檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量有重要影響的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。
（二）性能驗(yàn)證方案
1. 方法符合率：通過參比方法比較。
① 樣本：
◆ 選取陰性樣本至少 5 例、陽性樣本（宜包含弱陽性/低擴(kuò)增的樣本）， 一般不少于 10 例樣本。
注 1：罕見或少見病種的項(xiàng)目，可酌情減少樣本例數(shù)。
注 2：若弱陽性/低擴(kuò)增樣本不好獲取，可用適當(dāng)稀釋陽性樣本獲得類似的效果。
② 驗(yàn)證方法：
◆ 按照患者樣本檢測(cè)程序，采用參比方法和候選方法平行檢測(cè)。
◆ 將所有檢測(cè)結(jié)果按下表匯總填表，計(jì)算符合率。
陽性符合率=a/(a+c)×100%
陰性符合率=d/(b+d)×100%
總符合率=(a+d)/( a+b+c+d)×100%
③ 判斷標(biāo)準(zhǔn)：
◆ 實(shí)驗(yàn)室性能驗(yàn)證結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)是廠商或研發(fā)者在試劑盒或檢測(cè)系統(tǒng)說明書中聲明的性能指標(biāo)。
2. 檢出限：驗(yàn)證廠家試劑使用說明書等有聲明檢出限。
① 樣本：
◆ 定值標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（如：國際參考品、國家參考品、廠家參考品）。
◆ 對(duì)于報(bào)告具體基因型的方法，其選用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)需包括所有的突變類型。
② 驗(yàn)證方法：
◆ 使用定值標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的樣本梯度稀釋至廠家聲明的檢出限濃度。
◆ 可重復(fù)測(cè)定 5 次或在不同批內(nèi)對(duì)該濃度樣本進(jìn)行 20 次重復(fù)測(cè)定（如測(cè)定 5 天， 每天測(cè)定 4 份樣本）。
◆ 稀釋液可根據(jù)情況選用廠家提供的稀釋液或陰性血清，該陰性血清除被驗(yàn)證的目標(biāo)物必須陰性外，所含干擾物質(zhì)濃度必須在廠家聲明的范圍之內(nèi)。
③ 判斷標(biāo)準(zhǔn)：
◆ 如果是 5 次重復(fù)檢測(cè)，必須 100%檢出靶核酸；
◆ 如果是 20 次檢測(cè)，必須檢出 至少 18 次靶核酸。
3. 交叉反應(yīng)：
對(duì)于病原體核酸檢測(cè)來說，主要指與檢測(cè)對(duì)象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀的病原體核酸，宜在病原體感染的醫(yī)學(xué)決定水平進(jìn)行驗(yàn)證。
① 驗(yàn)證方法：
◆ 對(duì)于病原體核酸檢測(cè)，取一定濃度與待測(cè)核酸可能存在交叉反應(yīng)的病原體加入樣本保存液或經(jīng)確認(rèn)為陰性的樣本中，與常規(guī)樣本一樣處理，至少重復(fù)檢測(cè)3次；
◆ 對(duì)于基因型檢測(cè)，取一定濃度經(jīng)其它方法（如測(cè)序等）確認(rèn)為其它基因型的樣本，與常規(guī)樣本一樣處理，至少重復(fù)檢測(cè)3次。
② 判斷標(biāo)準(zhǔn)：
◆ 結(jié)果應(yīng)為陰性。
4. 抗干擾能力
分子診斷常見的干擾物質(zhì)主要包括血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、免疫球蛋白 G、類風(fēng)濕因子和藥物等。實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)臨床需求、廠家聲明和樣本特點(diǎn)（實(shí)際可能存在的干擾物質(zhì)及達(dá)到的濃度）選擇需要驗(yàn)證的干擾物質(zhì)及濃度。需要時(shí)，也應(yīng)評(píng)估抗凝劑和樣本保存液等對(duì)結(jié)果的影響。
① 驗(yàn)證方法：
實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況選擇驗(yàn)證方案。
◆ 方案 1：實(shí)驗(yàn)組為在弱陽性樣本中加入干擾物質(zhì)溶液（對(duì)照組加入等量的溶劑），使得干擾物質(zhì)的終濃度與廠家聲明的濃度相同，與常規(guī)樣本一樣處理，至少重復(fù)測(cè)定 3 次以上。
◆ 方案 2：選取含待驗(yàn)證的高濃度水平干擾物質(zhì)且經(jīng)確認(rèn)不含被測(cè)物的臨床樣本作為實(shí)驗(yàn)組，選取含低濃度水平干擾物質(zhì)且經(jīng)確認(rèn)不含被測(cè)物的臨床樣本作為對(duì)照組。分別在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中加入弱陽性樣本（量小于 10%），與常規(guī)樣本一樣處理，每組至少重復(fù)檢測(cè) 3 次。
② 判斷標(biāo)準(zhǔn)：
◆ 方案 1：弱陽性樣本檢測(cè)仍為弱陽性結(jié)果，則驗(yàn)證通過。
◆ 方案 2：如果對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組結(jié)果均為弱陽性，說明在驗(yàn)證濃度下，干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定無顯著影響。如果對(duì)照組結(jié)果為弱陽性，實(shí)驗(yàn)組結(jié)果為陰性，說明在驗(yàn)證濃度下，干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定有顯著影響。
二、PCR定量檢測(cè)項(xiàng)目
（一）性能驗(yàn)證參數(shù)
1. PCR 定量檢測(cè)選擇驗(yàn)證的性能指標(biāo)宜包括測(cè)量正確度、測(cè)量精密度（含測(cè)量重復(fù)性和測(cè)量中間精密度）、測(cè)量不確定度、分析特異性（含抗干擾能力）、分析靈敏度、檢出限和定量限、線性區(qū)間（可報(bào)告區(qū)間）等。
2. 如果檢驗(yàn)程序適用樣本類型包括血清與血漿，實(shí)驗(yàn)室在臨床檢測(cè)時(shí)同時(shí)使用 血清與血漿，應(yīng)進(jìn)行血清與血漿結(jié)果一致性的驗(yàn)證。
3. 驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目的預(yù)期用途以及生產(chǎn)制造商聲明，選擇對(duì)檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量有重要影響的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。
（二）性能驗(yàn)證方案
1. 正確度驗(yàn)證：實(shí)驗(yàn)室可采用偏倚評(píng)估、回收試驗(yàn)、與參考方法比對(duì)等方式進(jìn)行正確度的驗(yàn)證。
① 偏倚評(píng)估：
◆ 樣本: 按照如下優(yōu)先順序選用具有互換性的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或基質(zhì)與待測(cè)樣本相類似的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：
1)有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CRM），包括國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（如 GBW）、國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（如WHO、IFCC）、CNAS 認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者（RMP）提供的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、與我國簽署互認(rèn)協(xié)議的其他國家計(jì)量機(jī)構(gòu)提供的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（如NIST、JSCC）等；
2)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（RM），如廠商提供的工作標(biāo)準(zhǔn)品；
3)正確度控制品；
4)正確度驗(yàn)證室間質(zhì)評(píng)樣本，如 CNAS 認(rèn)可的 PTP 提供的正確度驗(yàn)證樣本。宜根據(jù)測(cè)量區(qū)間選用至少 2 個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣本。
◆驗(yàn)證方法：
每個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣本至少每天重復(fù)測(cè)定 2 次，連續(xù)測(cè)定 5 天，記錄檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算全部檢測(cè)結(jié)果的均值，并按公式計(jì)算偏倚。
偏倚 = 結(jié)果均值 − 參考值
② 與參考方法比對(duì)：
◆ 樣本：
適宜的臨床樣本，不少于 8 份，被測(cè)物濃度在測(cè)量區(qū)間內(nèi)均勻分布，并關(guān)注醫(yī)學(xué)決定水平。
◆ 驗(yàn)證方法：
按照患者樣本檢測(cè)程序，采用參比方法和候選方法平行檢測(cè)。
按照制造商說明書或作業(yè)指導(dǎo)書規(guī)定的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行校準(zhǔn)/校準(zhǔn)驗(yàn)證，宜在相同時(shí)段內(nèi)完成對(duì)同一樣本的兩種方法平行檢測(cè)，每份樣本每個(gè)檢測(cè)方法重復(fù)檢測(cè) 3 次，計(jì)算每份樣本兩種方法檢測(cè)結(jié)果的均值，并按照公式計(jì)算偏倚。
偏倚 = 結(jié)果均值 − 參考值
2. 精密度驗(yàn)證：精密度驗(yàn)證應(yīng)包括重復(fù)性和中間精密度。
① 樣本：
◆ 可采用新鮮或凍存的樣本。
◆ 當(dāng)樣本中待測(cè)物不穩(wěn)定或樣本不易得到時(shí)，也可考慮使用基質(zhì)與實(shí)際待檢樣本相似的樣本，如質(zhì)控品。
◆ 應(yīng)至少評(píng)估 2 個(gè)水平樣本的不精密度。當(dāng) 2 個(gè)水平樣本的不精密度有顯著差異時(shí)，建議增加為 3 個(gè)水平。
◆ 所選樣本的被測(cè)物水平應(yīng)在測(cè)量區(qū)間內(nèi)，適宜時(shí)，至少有 1 個(gè)樣本的被測(cè)物水平在醫(yī)學(xué)決定水平左右。
注意：
注 1：通常較高值樣本的不精密度較小，較低值樣本的不精密度偏大。對(duì)低值有臨床意
義的檢測(cè)項(xiàng)目，宜評(píng)估有判斷價(jià)值的低水平樣本的不精密度。
注 2：如檢測(cè)結(jié)果沒有明確的醫(yī)學(xué)決定水平，可在參考區(qū)間上限左右選一個(gè)濃度，再根
據(jù)檢驗(yàn)項(xiàng)目的特點(diǎn)在測(cè)量區(qū)間內(nèi)選擇另一個(gè)濃度。
注 3：如與廠商或文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的不精密度比較，所選樣本水平宜與被比較的樣本水平接近。
② 重復(fù)性驗(yàn)證：
◆ 驗(yàn)證方法： 對(duì)樣本進(jìn)行至少 10 次重復(fù)測(cè)定，計(jì)算均值、SD 和 CV。
◆ 質(zhì)量控制： 實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)至少檢測(cè)一個(gè)質(zhì)控品。當(dāng)質(zhì)控結(jié)果失控時(shí)，不論實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否滿意都應(yīng)棄去不用，重新進(jìn)行試驗(yàn)以取得全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
◆ 數(shù)據(jù)分析：依據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差。
③ 同時(shí)驗(yàn)證重復(fù)性和中間精密度：
◆ 驗(yàn)證方法：每天檢測(cè) 1 個(gè)分析批，每批檢測(cè) 2 個(gè)水平的樣本，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè) 3～5 次，連續(xù)檢測(cè) 5 天。在每一批次測(cè)量中，應(yīng)同時(shí)測(cè)量質(zhì)控品。
◆ 數(shù)據(jù)分析：
3. 可報(bào)告范圍驗(yàn)證：:定量分析方法的可報(bào)告范圍是臨床實(shí)驗(yàn)室發(fā)出檢驗(yàn)報(bào)告的依據(jù)之一，可報(bào)告范圍的驗(yàn)證包括可報(bào)告低限（定量下限）與可報(bào)告高限（定量上限×樣本最大稀釋倍數(shù)）。
① 樣本
◆ 宜選擇與待測(cè)樣本具有相同基質(zhì)的樣本。
② 樣本準(zhǔn)備
◆ 以血清樣本為例。
低值樣本準(zhǔn)備：將待測(cè)樣本（含被分析物）用混合人血清（含被分析物濃度水平較低）或 5%牛血清白蛋白生理鹽水溶液進(jìn)行稀釋，產(chǎn)生接近于方法測(cè)量區(qū)間低限（定量下限）濃度水平的樣本，通常為 3～5 個(gè)濃度水平，濃度間隔應(yīng)小于測(cè)量區(qū)間低限的 20%。
高值樣本準(zhǔn)備：使用混合血清或 5%牛血清白蛋白生理鹽水溶液或測(cè)定方法要求的稀釋液對(duì)高值待測(cè)樣本（必要時(shí)可添加被分析物，并計(jì)算出理論值）進(jìn)行稀釋，使其接近于線性范圍的上 1/3 區(qū)域內(nèi)，并記錄稀釋倍數(shù)。至少選用 3 個(gè)高濃度樣本，稀釋倍數(shù)應(yīng)為方法性能標(biāo)明的最大稀釋倍數(shù)并適當(dāng)增加或減小稀釋比例。
③ 驗(yàn)證方法
◆ 在一次運(yùn)行中將每個(gè)低值樣本重復(fù)測(cè)定 5～10 次，每個(gè)高值樣本重復(fù)測(cè)定 3次。
④ 數(shù)據(jù)分析
◆ 分別計(jì)算每個(gè)低值樣本的均值、SD、CV 值。
◆ 對(duì)高值樣本，計(jì)算乘以稀釋倍數(shù)后的還原濃度和相對(duì)偏差。
⑤ 可報(bào)告范圍的確定
◆ 可報(bào)告范圍低限（定量下限）
以方法性能標(biāo)示的總誤差或不確定度為可接受界值，從低值樣本結(jié)果數(shù)據(jù)中選取總誤差或不確定度等于或小于預(yù)期值的最低濃度水平作為可報(bào)告范圍低限。
◆ 可報(bào)告范圍高限
選取還原濃度與理論濃度的偏差（%）等于或小于方法預(yù)期偏倚值時(shí)的最大稀釋倍數(shù)為方法推薦的最大稀釋倍數(shù)，測(cè)量區(qū)間的高限與最大稀釋倍數(shù)的乘積為該方法可報(bào)告范圍的高限。可報(bào)告范圍高限的確定應(yīng)考慮臨床需求。
注：超出可報(bào)告范圍時(shí)，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果不能滿足其預(yù)期總誤差或不確定度的要求。
4. 分析特異性驗(yàn)證
① 樣本
◆ 宜選取被測(cè)量水平不同的 2 個(gè)樣本為基礎(chǔ)樣本，可參考醫(yī)學(xué)決定水平或參考區(qū)間限值。
② 干擾物質(zhì)選擇
◆ 宜根據(jù)檢測(cè)方法的原理和預(yù)期用途選擇常見的可能產(chǎn)生干擾作用的物質(zhì)。
③驗(yàn)證方法
◆ 干擾物原液中干擾物的濃度應(yīng)高于實(shí)驗(yàn)濃度 20 倍以上，以減少對(duì)基礎(chǔ)樣本基質(zhì)的稀釋作用。
◆ 重復(fù)檢測(cè)（n≥3)實(shí)驗(yàn)樣本和對(duì)照樣本，分別計(jì)算 2 組結(jié)果均值，和均值間的差值。
④ 判斷標(biāo)準(zhǔn)
◆ 滿足干擾標(biāo)準(zhǔn)時(shí)的最高干擾物濃度，應(yīng)符合檢測(cè)方法規(guī)定的要求。
5. 分析靈敏度驗(yàn)證
① 樣本
◆ 宜選取與待測(cè)樣本相同基質(zhì)的樣本，濃度或活性已知，且水平處于參考區(qū)間上限（或醫(yī)學(xué)決定水平）附近。
② 驗(yàn)證方法
◆ 在檢測(cè)方法正常運(yùn)行的條件下重復(fù)檢測(cè)樣本 3 次。
③ 判斷標(biāo)準(zhǔn)
◆ 實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合檢測(cè)程序規(guī)定的范圍，如企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。
資料來源：
CNAS-GL039：2019《分子診斷檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》
CNAS-GL037：2019《臨床化學(xué)定量檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
