1. 概述
普通的細菌毒素主要分成兩種，一種是細菌外毒素（Exotoxin）：它是一種有毒性的蛋白質(zhì)，是細菌在繁殖過程中所分泌在細菌體外產(chǎn)生的有毒物質(zhì)。產(chǎn)生外毒素的菌株，大多是革蘭氏陽性菌，還有白喉桿菌、破傷風桿菌、肉毒桿菌、金黃色葡萄球菌以及少數(shù)革蘭氏陰性菌。另一種是細菌內(nèi)毒素（Endotoxin，脂多糖）：為革蘭氏陰性菌的細胞壁的產(chǎn)物，細菌在正常生活中時并不會自行產(chǎn)生，只有在細菌死亡自溶并附著在其它細胞上后，才顯示其毒性。
細菌內(nèi)毒素與人類生活息息相關(guān)，人類賴以生存的水源中同樣含有細菌內(nèi)毒素，其量約為1~100EU/ml。然而當細菌內(nèi)毒素通過消化道進入人體時并不會產(chǎn)生影響，只有通過注射等方式進入血液時才會引起不同程度的危害。細菌內(nèi)毒素少量進入血液后會被肝臟枯否細胞滅活，不會對機體造成損害，若大量進入血液后就會引起熱原反應(yīng)，即發(fā)熱反應(yīng)。因此，注射劑在產(chǎn)品研發(fā)上市過程中控制細菌內(nèi)毒素很有必要。
2. 檢查方法
根據(jù)中國藥典2020版四部通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法中描述，細菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠限度試驗結(jié)果為準。
目前，凝膠法檢查法使用的較多，是一種限度檢測或半定量的一種檢驗方法，光度測定法可定量檢測細菌內(nèi)毒素。
2.1 凝膠法
2.1.1. 實驗原理
細菌內(nèi)毒素的檢查原理是通過觀察鱟試劑與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的現(xiàn)象，來判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定。
鱟試劑是一種無菌冷凍干燥品，由海洋生物鱟的血液變形細胞溶解物制成，其中含有能被微量細菌內(nèi)毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能夠檢測樣品中是否含有細菌內(nèi)毒素和（1,3）-β-葡聚糖激，準確、快速地定性或定量。
反應(yīng)原理如下：
2.1.2. 細菌內(nèi)毒素限度的制定
一般情況下，是按照中國藥典2020版四部通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法進行計算：
3. 示例：XX注射液
3.1 限度制定依據(jù)
本品規(guī)格為300ml：API I 45g與API II 15g。參比制劑說明書中的常規(guī)用量用法為3~10min內(nèi)滴注100ml，每1kg滴注7~20ml，每日API I最大劑量為200g，即本品每日最大劑量為1334ml。
根據(jù)上述公式，計算制劑的細菌內(nèi)毒素限度L：L=K/M=5EU/(kg·h)/1334ml/(60 kg·h)=0.22EU/ml。
國家藥品審評中心化藥藥物評價《細菌內(nèi)毒素檢查法研究中應(yīng)注意的幾個方面》中指出，大輸液內(nèi)毒素限度一般計為0.5EU/ml，所以擬定本品內(nèi)毒素限度為0.5EU/ml。
3.2 物料控制
在注射劑中細菌內(nèi)毒素貢獻占比最大，需要根據(jù)產(chǎn)品的細菌內(nèi)毒素來計算控制原輔料的細菌內(nèi)毒素。故需要對本品原輔包的細菌內(nèi)毒素制定合理的來源控制和過程控制：
3.2.1. API I
根據(jù)中國藥典2020年版四部通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法中公式，計算 API I的細菌內(nèi)毒素限度L：L=K/M=5EU/(kg·h) / 200g/(60 kg·h)=1.5EU/g
式中：
L為供試品細菌內(nèi)毒素限值，以EU/mg表示；
K為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，本品為注射劑，K=5EU/(kg·h)；
M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以mg/(kg·h)表示。人均體重按60kg計算，本品中API I臨床每小時最大使用劑量為200g，故本品M=200g/(60kg·h)。
收緊細菌內(nèi)毒素限度為≤0.5EU/g，并訂入API I進廠內(nèi)控質(zhì)量標準。
3.2.2. API II
本品規(guī)格為300ml：API I 45g與API II 15g。按照參比制劑說明書用法用量，每日API I最大劑量為200g，即本品每日最大劑量為1334ml，故每日API II最大劑量為66.67g。根據(jù)中國藥典2020年版四部通則1143細菌內(nèi)毒素檢查法中公式，計算API II的細菌內(nèi)毒素限度L：L=K/M=5EU/(kg·h) / 66.67g/(60 kg·h) = 4.5EU/g
收緊細菌內(nèi)毒素限度為≤0.23EU/g，并訂入API II進廠內(nèi)控質(zhì)量標準。
3.2.3. 注射用水
參考ChP2020（注射用水細菌內(nèi)毒素限度為≤0.25EU/ml），收緊限度為≤0.125EU/ml，并訂入內(nèi)控質(zhì)量標準。
3.2.4. 內(nèi)包材
直接接觸產(chǎn)品內(nèi)包材如西林瓶、膠塞、安瓿等，在生產(chǎn)使用時會要求除去細菌內(nèi)毒素并進行驗證，驗證標準是內(nèi)毒素能夠降低3個log值。在產(chǎn)品細菌內(nèi)毒素貢獻占比較小。本品使用的內(nèi)包材五層共擠輸液用膜袋（含塑料輸液容器接口和塑料輸液容器聚丙烯組合蓋）。參考FDA（≤0.5EU/ml），收緊包材組件的細菌內(nèi)毒素限度為0.25EU/ml，并訂入五層共擠輸液用膜袋內(nèi)控質(zhì)量標準。
3.3 結(jié)論
擬定本品的細菌內(nèi)毒素限度為0.5EU/ml（即150EU/袋），原輔料、注射用水和內(nèi)包材的細菌內(nèi)毒素總量按照內(nèi)控限度計算為133.45EU/袋，小于本品的擬定限度，計算結(jié)果具體見下表。從原輔料、注射用水和內(nèi)包材方面可以有效控制本品的細菌內(nèi)毒素，保證產(chǎn)品質(zhì)量。
4. 實驗過程
4.1 確定最大有效稀釋倍數(shù)
確定供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）。
MVD是指在試驗中供試品溶液被允許達到稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測。（如果無限稀釋供試品，內(nèi)毒素可能會檢測不出來。）
MVD=cL/λ
式中：
L為供試品的細菌內(nèi)毒素限值；
c為供試品溶液的濃度，當L以EU/ml表示時，則c等于1.0ml/ml，當L以EU/mg或EU/U表示時，c的單位需為mg/ml或U/ml。
λ為鱟試劑的標示靈敏度(EU/ml)【凝膠法】，或是標準曲線最低的內(nèi)毒素濃度【光度測定法】。
4.2 鱟試劑的靈敏度復核試驗
鱟試劑的靈敏度（EU/ml）為在檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)毒素的最低濃度。
如果使用新批次的鱟試劑，或者試驗條件發(fā)生了改變時，包括任何可能影響檢驗結(jié)果的改變，都要進行鱟試劑靈敏度復核試驗。復核的目的是為了確認鱟試劑的靈敏度，同時也考察了檢驗人員操作方法，并確認了試驗條件是否符合規(guī)定。
4.3 干擾試驗
干擾試驗是為產(chǎn)品使用細菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)，確定供試品在確定濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)都不存在干擾作用。在開發(fā)細菌內(nèi)毒素的檢查方法時，試驗前須進行干擾試驗。當試驗條件發(fā)生了改變時，包括鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何變化時，須進行干擾試驗。
4.4 供試品檢查
使用已經(jīng)過驗證的方法對制劑品種進行檢驗。
5. 小結(jié)
在注射劑的生產(chǎn)過程中，可能會從原輔料、生產(chǎn)過程、人員、設(shè)備以及環(huán)境等各個方面引入微生物及細菌內(nèi)毒素。為了保證藥物使用的安全性，各國法規(guī)標準對于注射劑的細菌內(nèi)毒素水平都有嚴格的規(guī)定，若沒有標準，也需要在研發(fā)過程中制定相應(yīng)的內(nèi)控標準。也同時要求生產(chǎn)企業(yè)在注射劑研發(fā)過程中采取合理的策略，嚴格控制注射劑中的細菌內(nèi)毒素含量。
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