脂溶性維生素A、D、E (VA、VD、VE) 是人體維持正常代謝和機能所必需的營養(yǎng)素。強化食品和特殊醫(yī)療用途等配方食品是補充維生素的重要途經(jīng)。準確測定食品中維生素含量對于科學膳食，并保證食品安全具有重要意義。
GB5009.82-2016是現(xiàn)行的關(guān)于食品中VA、VD、VE測定的標準方法，其適用范圍涵蓋嬰幼兒食品、乳品、肉與肉制品、食用植物油、堅果、豆類和辣椒粉等多種食物基質(zhì)。關(guān)于食品中維生素D測定的新標準方法GB5009.296-2023現(xiàn)已發(fā)布，將于2024年3月6日正式實施，新標準主要增加了固相萃取的樣品制備方法和在線二維柱切換的反相液相色譜法，本文按照標準的第二法，采用固相萃取法的樣品凈化方式，結(jié)合在線二維液相色譜方法，同時對嬰幼兒配方乳粉中VA、VD和VE進行了分析。
一、實驗步驟
1、溶液配制
1.1 抗壞血酸水溶液（0.2 g/mL）：4 g抗壞血酸，加20 mL的水溶解；
1.2 BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL）：稱取1 g BHT，加500 mL的乙醇溶解，臨用前配制；
1.3 50%（m/m）氫氧化鉀溶液：稱取50 g氫氧化鉀，溶于50 mL水中，冷卻后置聚乙烯瓶中；
1.4 5%甲醇水溶液：將5 mL甲醇和95 mL水混合均勻。
1.5 乙腈-甲醇混合溶液（3+1）：將30 mL乙腈和10 mL甲醇混合均勻。
2、樣品制備
注：處理過程應(yīng)避免紫外光照。
2.1 均質(zhì)樣品
稱取粉末試樣25 g（精確至0.01 g）至250 mL干燥玻璃瓶中，加入約200 g溫水（約40 °C～45 °C），記錄加水后的溶液質(zhì)量（精確至0.01 g）。充分混勻溶解，室溫避光放置15 min，每隔5 min振搖30 s。
2.2 皂化
稱取均質(zhì)后試樣5 g（精確至0.01 g）至50 mL帶螺旋蓋的離心管中，加入2 mL抗壞血酸水溶液（0.2 g/mL），6 mL BHT-乙醇溶液（0.2 g/100 mL），渦旋混勻30 s，再加入3 mL氫氧化鉀溶液，渦旋混勻后于80 ?C±2 ?C條件下避光渦旋振蕩30 min，立即冷卻，待提取凈化。
2.3 提取凈化
（1）活化：SelectCore vADE維生素專用柱200mg/6mL，依次使用6 mL甲醇、6 mL水活化；
（2）上樣：皂化液在8000 r/min下離心5 min。全部上清液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，過柱速度控制在每分鐘不超過60滴；
（3）淋洗：用10 mL 5%甲醇水溶液洗滌離心管，渦旋30 s，在8000 r/min下離心5 min，將上清液一并轉(zhuǎn)移到固相萃取柱上樣，重復操作2次，棄去淋洗液，真空抽至柱體近干；
（4）洗脫：用8 mL乙腈-甲醇混合溶液（3+1）分三次洗脫，負壓抽干，收集洗脫液加水定容至10 mL，溶液用0.45 μm Nylon針式過濾器過濾，取濾液作為待測液；
3、在線二維液相色譜法測定
3.1 在線二維液相色譜系統(tǒng)
儀器系統(tǒng): Agilent 1260 Infinity II二維系統(tǒng);
系統(tǒng)配置:
1260 Infinity II四元泵 (G7111B) ;
1260 Infinity II二元泵 (G7112B) ;
1260 Infinity II自動進樣器 (G7129A) ;
1260 Infinity II柱溫箱 (G7116A，內(nèi)置兩位六通閥) ;
1260 Infinity II VWD (G7114B×2) ;
1290 Infinity閥驅(qū)動 (獨立的閥驅(qū)動裝置，G1170A，配1個兩位六閥頭，在雙閥單檢測器的二維系統(tǒng)中使用) ;
儀器軟件: Agilent OpenLab CDS 2.6
在線二維柱切換液相色譜系統(tǒng)見圖1所示
圖1.在線二維液相色譜系統(tǒng)（A.單閥雙檢測器；B.雙閥單檢測器）
3.2 實驗條件
色譜柱：
第一維色譜柱: vADE-1D-A, 5μm, 4.6×150mm
第二維色譜柱: vADE-2D-A, 3μm, 2.1×100mm
捕集柱: vADE-Trap-A, 5μm, 4.6×10mm
捕集柱卡套: 分體式保護柱卡套
流動相和梯度程序:
表1梯度洗脫程序
流速:
第一維泵: 1.0 mL/min;
第二維泵: 0.4 mL/min;
閥切換程序( 圖1A和圖1B左閥 ) :
0.0~12.1 min, 1-6;
12.1~12.7 min, 1-2;
12.7~25.0 min, 1-6;
閥切換程序( 圖1B右閥 ) :
0-16.5 min, 1-6;
16.5-24.5 min, 1-2;
24.5-25.0 min, 1-6;
波長切換程序:
第一維: 0~9 min, 325 nm;
9~25 min, 294 nm;
第二維: 0~25 min, 264 nm;
進樣量: 100 μL
柱溫: 35 ℃
二、實驗結(jié)果與討論
1、二維捕集柱考察：
為考察二維接口上捕集柱的效果，本實驗按照確定的方法進濃度為5 μg/mL的VD2和VD3混合標準品溶液，在確認第一維目標峰的峰起點處開始切換閥至1-2位，結(jié)果由圖2可見，目標峰從開始切割的起點至從捕集柱中流穿起點近2 min，說明捕集柱對目標待測物的捕集效果較好，且捕集時間窗能夠完全滿足方法測試要求。
圖2.目標待測物VD的第一維色譜分離譜圖（A）以及切割至捕獲柱后的分離譜圖（B）
實驗 譜圖
按照確定的色譜條件，進VADE混合標準品溶液、樣品溶液和加標樣品溶液，結(jié)果見圖3和圖4，其中VD2和VD3的分離度＞2.0，完全滿足方法測試要求。
圖3.采用單閥雙檢測器的二維系統(tǒng)時維生素ADE混合標準品溶液(a)與樣品溶液(b)在第一維（A）與第二維（B）分離的對比譜圖（1, VA; 2, δ-VE; 3, β+γ-VE; 4, α-VE; 5, VD2; 6, VD3）
圖4.采用雙閥單檢測器的二維系統(tǒng)時維生素ADE混合標準品溶液(a)、加標樣品溶液(b)及樣品溶液(c)的疊加譜圖，其中0~16.5 min為第一維；16.5~24.5 min為第二維（1, VA; 2, α-TE; 3, δ-VE; 4, β+γ-VE; 5, α-VE; 6, VD2; 7, VD3）
2、線性關(guān)系及定量限考察
取維生素ADE的混合標準品溶液(VA濃度為1 μg/mL, 4種VE的濃度均為5 μg/mL, VD2和VD3濃度均為0.05 μg/mL)分別進樣5、10、20、50和100 μL，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，考察各待測分析物的線性相關(guān)關(guān)系。由表2結(jié)果可以看出，所有目標待測物分析物的線性相關(guān)關(guān)系較好（相關(guān)系數(shù)r2＞0.9999），其中定量限(LOQ)按S/N=10:1計算，VD2和VD3的LOQ分別為0.00116 μg/mL和0.00086 μg/mL；當固體取樣量為0.5 g，定容5 mL，進樣體積為100 μL時，VD2和VD3的方法定量限（MQL）為1.16和0.86 μg/100 g。
表2 線性相關(guān)關(guān)系及定量限考察
3、重復性考察
取同一樣品溶液，按照確定的色譜條件連續(xù)進樣5次，計算目標峰保留時間和峰面積的RSD。結(jié)果所有目標峰保留時間的RSD＜0.1%；VA峰面積RSD為1.56%；α-VE峰面積的RSD為0.12%；第二維中VD3峰面積的RSD為2.24%，表明本法重復性較好。
4、加標回收率數(shù)據(jù)
表3 樣品加標回收率測定結(jié)果
三、實驗結(jié)論
本實驗針對新發(fā)布的標準方法(GB5009.296-2023)食品中維生素D測定第二法進行了重現(xiàn)，采用固相萃取的樣品提取凈化方法，結(jié)果嬰幼兒配方奶粉基質(zhì)樣品中目標物分離無干擾，初步的方法學考察結(jié)果也表明本法準確可靠；且可同時完成維生素A和α-維生素E（α-VE）的定量。與傳統(tǒng)的液-液萃取方法比較，固相萃取法操作更簡便，無需繁復的多次萃取、水洗、脫水、旋蒸和氮吹、定容等步驟，同時也無需正相色譜的凈化步驟，可提升樣品分析通量，整個分析過程和結(jié)果更加可控，納譜分析推出的SelectCore vADE維生素專用柱是一種新型的單分散聚合物填料的固相萃取柱，相比市場上常見的聚合物產(chǎn)品，滴速更快，回收率更穩(wěn)定。另本法允許大體積進樣，以滿足VD含量較低的樣品基質(zhì)的分析要求。
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