超聲檢測原理是基于聲波傳播和反向散射行為，探查不同深度的非透明組織，并且無需調(diào)節(jié)樣本，是一種可以克服光衍射限制的非破壞性技術(shù)。該技術(shù)通過定量成像方法、補(bǔ)償聲學(xué)效應(yīng)以及利用體積成像進(jìn)行生物支架的可視化分析，從而提供客觀、準(zhǔn)確且實(shí)時(shí)的生物支架開發(fā)表征數(shù)據(jù)，在研究軟骨修復(fù)策略領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。
本期，EFL 以發(fā)表在雜志《Acta Biomaterialia》上的“Standardised quantitative ultrasound imaging approach for the contact-less three-dimensional analysis of neocartilage formation in hydrogel-based bioscaffolds”研究為例，介紹一種通過對(duì)從組織中返回的射頻信號(hào)進(jìn)行頻譜分析來實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的定量超聲成像（SQUI）方法。作者以基于GelMA水凝膠構(gòu)建不同軟骨成熟水平的體外組織為例，來驗(yàn)證SQUI方法的應(yīng)用潛力。
1. 為什么選擇GelMA水凝膠構(gòu)建不同軟骨成熟水平的體外組織？
GelMA水凝膠具有成分清晰，透光性好的優(yōu)點(diǎn)，常見應(yīng)用于各種水凝膠成像和分析技術(shù)。同時(shí)，GelMA水凝膠具有生物相容性優(yōu)，光照機(jī)械性能可調(diào)的特點(diǎn)，滿足該研究通過改變GelMA濃度（6%，8%，10% w/v）和培養(yǎng)時(shí)間（0，14，28天）來構(gòu)建具有不同軟骨成熟水平的體外組織模型的需求，這種可控的變化對(duì)于研究軟骨組織工程的動(dòng)態(tài)至關(guān)重要。（EFL可提供系列GelMA產(chǎn)品，點(diǎn)擊文字查看詳細(xì)介紹 ）
2. 如何利用SQUI方法？
1）本文所研究的生物支架和所用超聲設(shè)備的概述
圖1 本研究所檢測的樣品及實(shí)驗(yàn)裝置。
2）生物學(xué)表征
在進(jìn)行SQUI方法評(píng)估前，作者先評(píng)估人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞（hADSCs）在光交聯(lián)GelMA水凝膠生物支架中經(jīng)軟骨分化后的透明軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)差異化情況。評(píng)估包括對(duì)透明軟骨標(biāo)志物（II型膠原蛋白和膠原纖維）的定量、II型膠原基因表達(dá)和提取的糖胺聚糖（GAG）。結(jié)果表明，GelMA濃度對(duì)II型膠原蛋白生物標(biāo)志物COL2A1的含量有顯著影響，并與GelMA濃度成反比。
圖2 調(diào)控負(fù)載脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞GelMA支架構(gòu)建不同的體外新生軟骨組織。
3）聲速、衰減和厚度的輪廓掃描
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聲速和衰減的輪廓，生物支架輪廓周圍的聲速值被低估，衰減圖像中出現(xiàn)雙環(huán)異常高衰減的偽影。這種偽影被歸因于換能器近場焦點(diǎn)與生物支架表面的相互作用，引起聲波束的折射。為了排除這些輪廓偽影，并評(píng)估支架整體的聲學(xué)屬性，選擇了支架內(nèi)部直徑約2mm的感興趣區(qū)域（ROI）。
圖3 無細(xì)胞和載細(xì)胞GelMA生物支架的輪廓掃描數(shù)據(jù)分析結(jié)果。
4）生物支架的2D/3D超聲成像
標(biāo)準(zhǔn)化定量超聲成像（SQUI）方法可視化分析了生物支架的微觀結(jié)構(gòu)和總體形態(tài)，并對(duì)2D原始灰度圖像與其對(duì)應(yīng)的局部衰減和IBC圖像進(jìn)行了比較。2D-IBC圖像顯示了GelMA濃度的顯著差異?；贗BC圖像與顯微鏡圖像的相似性，假設(shè)高強(qiáng)度IBC特征歸因于ECM（細(xì)胞外基質(zhì)）的區(qū)域。3D圖像顯示了全局和閾值化IBC值。然后處理了生物支架足跡上每個(gè)柵格掃描平面的標(biāo)準(zhǔn)化2D-IBC圖像，并結(jié)合處理后的2D-IBC圖像形成了3D-IBC圖像。
圖4 第28天GelMA載細(xì)胞生物支架的代表性2D-IBC圖像。
圖5 不同時(shí)間點(diǎn)的GelMA載細(xì)胞支架的側(cè)視3D-IBC圖像。
5）3D-IBC圖像的體積量化
對(duì)渲染的3D圖像進(jìn)行了總結(jié)，使其能夠進(jìn)行定量評(píng)估。這些圖像通過其IBC分布的體積直方圖進(jìn)行了分析。對(duì)于不同GelMA濃度（6%、8%、10%）的細(xì)胞生物支架，結(jié)果表明軟骨生成過程中的單調(diào)增加，特別是在log IBC區(qū)間-2.8至-1.4。對(duì)于10%的生物支架，與其他生物支架相比，28天時(shí)直方圖值出現(xiàn)衰減。
圖6 基于3D-IBC圖像計(jì)算獲得的體積直方圖。
6）Sonomarker強(qiáng)度作為軟骨形成描述符的鑒定&基于Sonomarker強(qiáng)度分析細(xì)胞生物支架
評(píng)估了體積直方圖以探究在軟骨形成過程中是否有特定的IBC強(qiáng)度經(jīng)歷了較大的變化，確定了聲學(xué)標(biāo)記（sonomarker）的強(qiáng)度，作為軟骨形成的描述標(biāo)志，對(duì)描述生物支架體積屬性及其在軟骨形成不同時(shí)間點(diǎn)的變化具有重要作用。
圖7 將3D-IBC圖像定量為體積直方圖，并識(shí)別新軟骨sonomarker強(qiáng)度。
7）基于Sonomarker下的生物支架選擇性成像
通過在特定的聲學(xué)標(biāo)記Sonomarker呈現(xiàn)的3D圖像，有助于可視化生物支架的微觀結(jié)構(gòu)和ECM（細(xì)胞外基質(zhì)）的發(fā)展。
圖8 基于新生軟骨sonomarker強(qiáng)度，可視化GelMA生物支架的微觀結(jié)構(gòu)。
8）Sonomarker強(qiáng)度與生物標(biāo)志物的相關(guān)性
探討了Sonomarker強(qiáng)度與生物標(biāo)記之間的相關(guān)性。使用線性回歸分析比較了聲學(xué)標(biāo)記直方圖與軟骨形成第28天時(shí)的主要生物標(biāo)記（GAG、COL2A1和膠原纖維）之間的關(guān)系。聲學(xué)標(biāo)記的強(qiáng)度與這些生物標(biāo)記顯示出良好的相關(guān)性。
圖9 Sonomarker強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)新軟骨生物標(biāo)志物的相關(guān)性。
9）SQUI方法在人類關(guān)節(jié)軟骨樣本上的應(yīng)用
研究了SQUI方法在人類關(guān)節(jié)軟骨樣本上的應(yīng)用，以驗(yàn)證新軟骨聲學(xué)標(biāo)記在天然組織中的相關(guān)性。這表明了SQUI方法在非破壞性分析軟骨再生方面的潛力。
圖10 基于SQUI方法對(duì)人關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本的聲學(xué)評(píng)價(jià)。
3. 本文的創(chuàng)新點(diǎn)
本文的創(chuàng)新性主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：
（1）標(biāo)準(zhǔn)化定量超聲成像（SQUI）技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用：本研究開發(fā)了一種新的超聲成像方法，即SQUI，用于非破壞性三維成像和定量分析水凝膠基生物支架中的軟骨形成。這種方法克服了傳統(tǒng)成像技術(shù)的限制，如需破壞樣品或無法提供三維數(shù)據(jù)。
（2）生物支架的詳細(xì)聲學(xué)特性分析：該研究不僅評(píng)估了生物支架的形態(tài)變化，還通過測量聲速、衰減和厚度等聲學(xué)參數(shù)，對(duì)其物理和生物特性進(jìn)行了全面分析。這為理解生物支架在軟骨工程中的行為提供了新的視角。
（3）定量分析與生物標(biāo)志物的關(guān)聯(lián)：研究通過定量超聲成像技術(shù)分析了生物支架中新生軟骨形成的過程，并將其與傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物（如II型膠原、GAG）相關(guān)聯(lián)。這種方法的開發(fā)為評(píng)估和監(jiān)測生物支架中細(xì)胞活動(dòng)和組織再生提供了新的工具。
（4）3D圖像的渲染與分析：通過渲染和分析3D-IBC圖像，本文展示了生物支架在軟骨生成過程中的形態(tài)變化。這種三維視角對(duì)于理解和優(yōu)化生物支架的設(shè)計(jì)至關(guān)重要。
（5）聲學(xué)標(biāo)記的識(shí)別和應(yīng)用：研究中識(shí)別了特定的聲學(xué)標(biāo)記強(qiáng)度，并將其用于分析生物支架的特性。這種方法的創(chuàng)新在于使用聲學(xué)參數(shù)作為評(píng)估和描述生物支架中軟骨形成的新指標(biāo)。
4. 總結(jié)
該研究展示了超聲波的非破壞性體積和定量成像技術(shù)，在檢測以GelMA為基質(zhì)的3D生物支架中新生軟骨形成的潛力。通過標(biāo)準(zhǔn)化定量超聲成像（SQUI）方法與批量輪廓掃描的結(jié)合，以及3D圖像渲染技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)生物支架相關(guān)軟骨新生形態(tài)和理化性能改變的監(jiān)測。
文獻(xiàn)來源：https://doi.org/10.1016/j.actbio.2022.05.037
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
