本案例自于ISPE Product Quality Lifecycle Implementation® (PQLI®) Guide Series，其中PQLI第二部分給出了一個小分子原料藥的案例，涉及Grignard反應(yīng)、結(jié)晶、干燥三個單元操作，該案例較之前在注冊圈分享的基于QbD的2.3.S.2.6的申報案例更全面，更系統(tǒng)，更有實用價值。首先介紹第一個單元操作：Grignard（格氏）反應(yīng)的開發(fā)。
一、前期工作
二、Grignard反應(yīng)的先驗知識
三、Grignard反應(yīng)的初步風(fēng)險評估
四、Grignard反應(yīng)工藝開發(fā)
五、關(guān)鍵工藝參數(shù)的風(fēng)險降低
5.1工藝參數(shù)
5.2物料屬性
六、 Grignard反應(yīng)設(shè)計空間
七、 Grignard反應(yīng)工藝開發(fā)研究之后的風(fēng)險評估
八、 為確定控制策略選項進行的工藝開發(fā)
8.1 控制策略1（前饋）
8.2 控制策略2（反饋）
九、 結(jié)論
一、前期工作
該原料藥PaQLInol用于簡單片劑直壓工藝，評估的潛在CQA及標(biāo)準(zhǔn)如下：
通過初始風(fēng)險評估，明確應(yīng)將注意力集中在Grignard反應(yīng)、結(jié)晶、粒度降低和干燥步驟上。
簡單的流程描述如下："將起始物料酮前體A溶于無水THF中。以恒定的速度加入同樣在無水THF中的Grignard試劑，并與酮前體A反應(yīng)生成粗品。非均相反應(yīng)混合物在攪拌下懸浮，反應(yīng)結(jié)束后通過過濾分離出粗品。濕濾餅可直接用于下一步驟。
Grignard反應(yīng)主反應(yīng)和競爭反應(yīng)如下：
▲圖1-Grignard反應(yīng)主反應(yīng)和競爭反應(yīng)
二、Grignard反應(yīng)的先驗知識
a.文獻(xiàn)和以往的經(jīng)驗表明，Grignard試劑與任何殘留水（溶劑和起始原料中的殘留水）發(fā)生反應(yīng)的速度要快于起始原料酮前體A。Grignard試劑的濃度也可能因批次而異。
b.從化學(xué)文獻(xiàn)中得知，過量的Grignard試劑，無論是摩爾總量過量還是由于局部濃度過高，都會與粗品發(fā)生反應(yīng)（過量反應(yīng)或雙重加料），形成雜質(zhì) C（見圖1）。攪拌速率和加料速率的控制可能是影響雜質(zhì)C含量的兩個關(guān)鍵因素，可能需要進行研究。該反應(yīng)比酮前體 A 和Grignard試劑之間的反應(yīng)要慢得多。
c.由于Grignard試劑的加料具有高放熱性（從文獻(xiàn)中得知并已計入危害分析），因此有必要控制加料速率和攪拌速率，以確保在Grignard試劑加料過程中最大限度地減少局部過熱（下稱"熱點"），根據(jù)初步危害分析（出于工藝安全考慮），建議最高溫度保持在8°C以下。
d.如第一點所述，水會迅速與Grignard試劑反應(yīng)生成雜質(zhì)B。酮前體A和溶劑THF中也含有一定量的水。這些含量在不同批次中會有所不同，因此，由于這種反應(yīng)比Grignard試劑反應(yīng)本身更快，要有效生產(chǎn)粗品PaQLInol，需要不同的和過量的Grignard試劑摩爾含量。而雜質(zhì)B是一種醇類，易溶于THF溶劑，很容易從反應(yīng)中清除。為盡量減少雜質(zhì)B的形成，可設(shè)定THF和酮前體A中水含量的接受標(biāo)準(zhǔn)，作為控制策略的要素。
e.剩余的酮前體（雜質(zhì)A）也可溶于THF溶劑中，因此很容易從反應(yīng)中清除?？傊?，現(xiàn)有知識表明，考慮到患者和商業(yè)的需求，需要對Grignard反應(yīng)進行深入研究，并有可能根據(jù)上述原因和下表所示的總結(jié)進行良好控制。
三、Grignard反應(yīng)的初步風(fēng)險評估
根據(jù)上述的先驗知識進行初步風(fēng)險評估。下表以風(fēng)險矩陣的形式展示了這一評估。
在這種情況下，初始險評估是定性的，而且相對非正式，因為有關(guān)可能發(fā)生故障的程度或發(fā)生故障的可能性的詳細(xì)知識尚未開發(fā)出來。因此，風(fēng)險評級分為高、中、低三個等級。初步風(fēng)險評估使用因果矩陣來評估工藝參數(shù)、物料屬性與CQA之間的潛在函數(shù)關(guān)系。其中大部分是之前制定的清單中的潛在CQA。進行風(fēng)險評估的一部分價值在于達(dá)成一致或理解，即特定的單元操作可能會或可能不會影響特定的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）。在這個實踐中，假設(shè)雜質(zhì)的接受標(biāo)準(zhǔn)得到滿足，那么含量的接受標(biāo)準(zhǔn)也會得到滿足。下表提供了關(guān)于這些關(guān)系的額外知識。
四、Grignard反應(yīng)工藝開發(fā)
本節(jié)描述了工藝開發(fā)研究，以理解風(fēng)險評估確定的潛在關(guān)鍵工藝參數(shù)和物料屬性對關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）的影響，使用在線過程分析技術(shù)工具（NIR）。初始風(fēng)險評估用于確定需要進行的實驗，以評估潛在關(guān)鍵工藝參數(shù)和物料屬性，并理解它們對粗品PaQLInol中雜質(zhì)A和C兩個CQAs的影響，其接受標(biāo)準(zhǔn)為不超過0.5%。因此，在粗PaQLInol階段的不超過0.5%的限度將確保在PaQLInol成品中達(dá)到不超過0.5%的水平。從這些初步研究中，選擇了反應(yīng)溫度、攪拌速率、Grignard加料速率和Grignard加入后的攪拌時間進行第一次實驗評估。采用基于DoE方法來評估參數(shù)范圍和相互作用。
在實驗設(shè)計中，使用在線近紅外光譜法來監(jiān)測酮前體A的濃度，從而確定反應(yīng)的終點。本例的目的不是討論闡明反應(yīng)的熱力學(xué)或動力學(xué)細(xì)節(jié)。然而，通常會調(diào)整加料速率、攪拌速率和溫度以評估主要速率常數(shù)和活化能。
實驗結(jié)果表明，近紅外光譜法可以監(jiān)測殘留的酮前體A至低于0.5%的水平，并且PaQLInol和雜質(zhì)C的形成速率常數(shù)與溫度有關(guān)。
以上研究結(jié)果展示了反應(yīng)溫度、攪拌速率和Grignard試劑加料速率與雜質(zhì)A和C之間的關(guān)系。例如，下表給出了攪拌速率、Grignard試劑加料速率和雜質(zhì)C之間的關(guān)系，表中的數(shù)值表示雜質(zhì)C的水平。為了說明，Grignard試劑加料速率可以表示為單位時間內(nèi)每摩爾酮前體A所需的Grignard試劑摩爾數(shù)，而攪拌速率最初可以表示為反應(yīng)器中的每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)。雜質(zhì)C的接受標(biāo)準(zhǔn)為不超過0.5%。
在圖2中，我們可以看到在Grignard試劑加料速率恒定（最大）的情況下，攪拌速率與雜質(zhì)C水平之間的關(guān)系。
▲圖2- 最大速率格氏試劑加料時，攪拌混合對雜質(zhì)形成的影響及CFD模型預(yù)測
進一步進行一系列研究，以理解傳熱傳質(zhì)，并旨在理解和預(yù)測規(guī)模和設(shè)備變化的影響。所有先前的實驗都是在小尺度上進行的。有幾種方法可以開發(fā)對規(guī)模影響的基本理解，例如：
● 計算流體力學(xué)（CFD）
● 確定功率和質(zhì)量之間的經(jīng)驗關(guān)系
對于PaQLInol，構(gòu)建了一個CFD模型，將混合程度與輸入能耗聯(lián)系起來，而輸入能耗又來源于攪拌速率和攪拌器的物理特性。通過這個模型，可以證明在擬議的商業(yè)反應(yīng)器的最低攪拌速率和Grignard試劑的最大加料速率下，雜質(zhì)C的水平約為0.5%。在圖2中，右邊的垂直虛線表示商業(yè)規(guī)模反應(yīng)器的最慢攪拌速度在實驗室規(guī)模下的預(yù)測值。這個模型有助于確認(rèn)保持?jǐn)嚢杷俾首鳛殛P(guān)鍵工藝參數(shù)的必要性。
然后，CFD模型可以用來重新計算攪拌速率與混合程度之間的關(guān)系，從而產(chǎn)生一系列與規(guī)模無關(guān)的y軸數(shù)值，如下表所示。
溫度確實會影響雜質(zhì)A和C的形成速率；然而，在-5°C和+8°C的溫度范圍內(nèi)，對雜質(zhì)A和C的水平?jīng)]有影響。可以得出以下結(jié)論：
a.在-5°C和+8°C的溫度范圍內(nèi)，對雜質(zhì)A和C的水平?jīng)]有影響。在這個溫度范圍內(nèi)，溫度不是關(guān)鍵因素，整體上具有較低的關(guān)鍵性。
b.攪拌速率，以混合能量表示，以及Grignard試劑的加料速率會影響雜質(zhì)C的水平；然而，在這些參數(shù)中存在廣泛的范圍，在這個范圍內(nèi)可以生產(chǎn)出令人滿意的粗品PaQLInol。由于這些參數(shù)的變異性會影響雜質(zhì)C這一關(guān)鍵質(zhì)量屬性，因此這些參數(shù)是關(guān)鍵的。
c.一種CFD模型預(yù)測了規(guī)模效應(yīng)，例如對攪拌速率的影響。使用這種CFD模型時，設(shè)備之間的攪拌速率差異并不重要。
d.對于所研究的Grignard試劑的摩爾比條件下，在Grignard試劑加入完成后的攪拌時間對雜質(zhì)A和C的水平?jīng)]有影響。
e.有必要進行研究以探究Grignard試劑用量與雜質(zhì)C水平之間的關(guān)系。
一系列單變量研究考察了Grignard試劑用量與固定加料速率和攪拌速率水平下的雜質(zhì)C之間的關(guān)系，并得出結(jié)論：在Grignard試劑與酮前體A的摩爾比為1.1至1.2的范圍內(nèi)，可以得到最大化收率，同時確保粗品PaQLInol中雜質(zhì)C水平低于0.5%。
先驗知識表明，Grignard試劑與反應(yīng)中其他試劑所含水的摩爾比為0.9至1.1時，剩余足夠的Grignard試劑可以產(chǎn)生良好的收率和可接受的雜質(zhì)A和C水平。
五、關(guān)鍵工藝參數(shù)的風(fēng)險降低
根據(jù)工藝開發(fā)研究的結(jié)果，以下是一份總結(jié)，并將其放在擬議的實際控制策略的背景下。
5.1 工藝參數(shù)
出于工藝安全原因，溫度將限制在+8°C以下。在工廠基于鹽水的冷卻系統(tǒng)的溫度范圍（-5°C至+8°C）內(nèi)，對任何關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）都沒有影響。因此，在此范圍內(nèi)，溫度不是關(guān)鍵因素。然而，溫度確實會影響到范圍之外的雜質(zhì)A和C的水平，冷卻系統(tǒng)的故障可能會帶來問題。由于可以輕易檢測到范圍之外的溫度，因此溫度成為一個低關(guān)鍵性的工藝參數(shù)。
攪拌速率和Grignard試劑的加料速率仍然是關(guān)鍵因素，通過對這兩個參數(shù)之間關(guān)系的理解可知，存在可接受的參數(shù)范圍，在這個范圍內(nèi)可以生產(chǎn)出符合要求的粗品PaQLInol 。所需的攪拌速率可以通過計算流體力學(xué)模型計算得出。
5.2 物料屬性
Grignard試劑的用量與整體雜質(zhì)譜息息相關(guān)，這一點可以從先驗知識和上述工藝研究中得到證實。當(dāng)Grignard試劑的加料速率較高而攪拌速率較低時，會產(chǎn)生較高水平的雜質(zhì)C。Grignard試劑的不足會導(dǎo)致殘留酮前體A的含量較高（從而導(dǎo)致收率較低），而過量的Grignard試劑則會導(dǎo)致較高水平的雜質(zhì)C。由于Grignard試劑的濃度會因批次而異，因此需要為每個批次確定濃度，并根據(jù)酮前體A的輸入量計算所需加料的量。通過單變量研究確定，Grignard試劑與酮前體A的摩爾比應(yīng)為1.1至1.2。
輸入物料，如酮前體A和反應(yīng)溶劑THF，都含有一定水分殘留，這會導(dǎo)致Grignard試劑的分解；因此可能導(dǎo)致未反應(yīng)的酮前體A增加（從而導(dǎo)致收率較低），以及較高水平的雜質(zhì)B。由于水分含量可能會因批次而異，最好根據(jù)實際測量的所有相關(guān)輸入物料的水分含量來調(diào)整Grignard試劑的加料量。根據(jù)對該Grignard試劑反應(yīng)性的先前理解，所需的過量Grignard試劑量為輸入物料中水分的摩爾量的0.9至1.1倍。作為額外的保證，對輸入物料、THF和酮前體A都進行了殘留水分的控制并制定了殘留水分的可接受標(biāo)準(zhǔn)。
六、Grignard反應(yīng)設(shè)計空間
包括原料中總水含量的物質(zhì)屬性以及攪拌速率和加料速率這兩個關(guān)鍵工藝參數(shù)的組合。
因此，當(dāng)Grignard試劑的濃度在(1.1至1.2)×酮前體A的量+ (0.9至1.1)×酮前體A和THF中的總摩爾水量的范圍內(nèi)，并且Grignard試劑的加料速率和混合能耗在本文第四部分表格的左下方區(qū)域內(nèi)時，粗品PaQLInol中的雜質(zhì)C含量低于0.5%。
七、Grignard反應(yīng)工藝開發(fā)研究之后的風(fēng)險評估
根據(jù)FMECA風(fēng)險分析來判斷關(guān)鍵程度，關(guān)鍵性評估總結(jié)見下表。
在這種情況下，溫度在-5°C至+8°C的溫度范圍內(nèi)被評估為低風(fēng)險或非關(guān)鍵，因為設(shè)備的限制使得該過程在設(shè)定的操作范圍內(nèi)運行，盡管溫度偏離可能會導(dǎo)致雜質(zhì)譜的變化，但溫度在反應(yīng)過程中很容易監(jiān)測到；因此，溫度偏離很容易被監(jiān)測到，風(fēng)險較低。對于Grignard試劑加料后的攪拌時間，它與任何關(guān)鍵質(zhì)量屬性都沒有關(guān)系，因此任何偏離或故障都不會影響產(chǎn)品質(zhì)量，這意味著該工藝參數(shù)不是關(guān)鍵的（請參見表中的第三列，右側(cè)列給出了解釋）。
八、為確定控制策略選項進行的工藝開發(fā)
本部分描述了建立控制策略選項的工藝開發(fā)工作，并展示了通過實施適當(dāng)?shù)目刂撇呗詠斫档惋L(fēng)險。
總結(jié)了不同控制策略選項的風(fēng)險，并給出了首選控制策略的理由。
通過根據(jù)工廠冷卻系統(tǒng)限制溫度范圍，并認(rèn)識到反應(yīng)后攪拌時間對相關(guān)的質(zhì)量屬性沒有影響，剩下的需要是控制Grignard試劑的用量（基于輸入物料的投料量和殘留水含量），攪拌速率，加料速率，并確定規(guī)模的潛在影響。這些問題在下一節(jié)中進行了討論。實驗工作的一部分包括對關(guān)鍵工藝參數(shù)的不同控制策略選項進行測試。這些控制策略選項的測試計劃如下表所示。
大多數(shù)單元操作中，過程控制可以基于輸入物料屬性和工藝參數(shù)（前饋）或通過測量一個或多個輸出屬性（反饋）來進行。
8.1 控制策略1（前饋）
在設(shè)計空間內(nèi)選擇恒定的加料速率和恒定的攪拌速率。
根據(jù)在線近紅外測量的Grignard濃度和輸入物料的水含量計算可調(diào)節(jié)的Grignard試劑體積。
設(shè)定酮前體A和THF中的含水驗收標(biāo)準(zhǔn)，以限制雜質(zhì)B的生成量。
控制策略1（前饋）的缺點是它可能對規(guī)模敏感。然而，這是一種相對簡單的控制策略實施。該控制策略的風(fēng)險評估見下表。
8.2 控制策略2（反饋）
在設(shè)計空間內(nèi)選擇恒定的加料速率和恒定的攪拌速率。
通過在線近紅外測量反應(yīng)完成情況，實時監(jiān)測剩余的酮前體A和雜質(zhì)C，確定可調(diào)節(jié)的Grignard試劑的體積。
設(shè)定在酮前體A和THF中的含水量的接受標(biāo)準(zhǔn)，以限制雜質(zhì)B的形成量。
對于控制策略2，近紅外（NIR）被放置在Grignard試劑加料區(qū)域旁邊。每隔兩分鐘獲取一次NIR光譜。通過NIR光譜可以預(yù)測雜質(zhì)C和剩余的酮前體A的濃度。連續(xù)五次測量得到的酮前體A濃度下降的斜率可以實時提供給操作人員。此外，預(yù)測的雜質(zhì)C濃度也可以實時獲取。當(dāng)剩余酮前體A的濃度低于0.5%且斜率為0時，停止Grignard試劑的加入，反應(yīng)繼續(xù)進行，以獲得符合要求的雜質(zhì)C（小于0.5%）和雜質(zhì)A（小于0.5%）的水平。
在開發(fā)過程中，證明了在Grignard試劑加入完成后，攪拌可以繼續(xù)進行15分鐘，不會對雜質(zhì)A和雜質(zhì)C的可測量水平產(chǎn)生影響。
圖3顯示了當(dāng)Grignard試劑過量時，酮前體A的消失（用鉆石表示）和雜質(zhì)C的增加（用方塊表示）。在這種情況下，Grignard試劑的加入持續(xù)到11分鐘，然后實驗停止。
▲圖3-Grignard反應(yīng)的近紅外監(jiān)測
在線近紅外（NIR）技術(shù)在小規(guī)模和商業(yè)規(guī)模上都可以獲得類似的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，無論Grignard濃度和輸入物料的實際水含量如何，控制策略2都能夠在商業(yè)規(guī)模上確保產(chǎn)品質(zhì)量（雜質(zhì)C）。對于這種控制策略，攪拌速率和加料速率仍然是唯一的低風(fēng)險關(guān)鍵工藝參數(shù)。下表給出了對控制策略2的風(fēng)險評估。
控制策略1和2的風(fēng)險評估比較表明，控制策略2具有較低的整體風(fēng)險，尤其是如果企業(yè)希望在制造規(guī)模上具有靈活性。從技術(shù)上講，它也是一種較低風(fēng)險的選擇，因為對物料屬性的分析較少，計算較少。反應(yīng)進程實時測量，確保良好的收率，并直接測量雜質(zhì)C這一CQA的水平。
下表對選擇控制策略2的重要元素給出了更詳細(xì)的描述。
九、結(jié)論
一系列的研究增加了工藝參數(shù)和物料屬性對CQAs、雜質(zhì)A和雜質(zhì)C水平以及商業(yè)需求的影響的理解。下表中的工藝參數(shù)和物料屬性已被確定為關(guān)鍵因素（它們的變異性會影響到CQA），并給出了關(guān)鍵性評估。
在所有情況下，通過使用在線監(jiān)測Grignard反應(yīng)中雜質(zhì)A和雜質(zhì)C水平的控制策略2，并在雜質(zhì)A水平低于0.5％時停止反應(yīng)，可以將失敗風(fēng)險降低到低水平。
在本案例中，提出并總結(jié)了Grignard反應(yīng)單元操作的設(shè)計空間。一個令人滿意的工藝單元被開發(fā)出來，工藝設(shè)計階段完成，并提出了相關(guān)的控制策略要素。該工藝已經(jīng)準(zhǔn)備好進行工藝性能確認(rèn)（PPQ）。有足夠的信息來編寫PPQ方案并為持續(xù)工藝確認(rèn)做準(zhǔn)備。
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