近年來(lái)，小核酸藥物成為生物制藥企業(yè)的研發(fā)熱點(diǎn)，小核酸藥物專指靶向作用于RNA或蛋白質(zhì)的一類寡核苷酸分子，包括反義寡核苷酸（ASO）、siRNA、aptamer等。截至目前，我國(guó)已上市的小核酸藥物總共有兩款，一款為諾西那生鈉（spinraza）全球首個(gè)用于治療兒童和成人脊髓性肌萎縮癥（SMA，致命性遺傳?。┑男滤?，2019年spinraza在中國(guó)獲批；另外一款為樂(lè)可為（leqvio），是一款長(zhǎng)效降脂藥，2023年08月在中國(guó)獲批；這兩款藥均是進(jìn)口至中國(guó)。通過(guò)查詢CDE得知，諾西那生鈉和樂(lè)可為的注冊(cè)分類屬于化學(xué)藥5.1類。
雖然小核酸藥物是按照化學(xué)藥物申報(bào)，那么小核酸藥物的研究要點(diǎn)有哪些？下面從序列設(shè)計(jì)思路、單體合成、序列合成、質(zhì)量控制、遞送系統(tǒng)等五個(gè)方面進(jìn)行討論。
序列設(shè)計(jì)思路
小核酸藥物的序列是藥物的核心，序列的設(shè)計(jì)也是重中之重的任務(wù)，下面我們來(lái)粗略地探討下序列設(shè)計(jì)的思路。
首先需要確定ASO的基本需求，確定是屬于招募RNase-H還是不招募RNase-H；根據(jù)文獻(xiàn)得知，ASO的作用機(jī)制主要分為兩類，一類為招募RNase-H，另一類是不招募RNase-H；在ASO與目標(biāo)RNA結(jié)合后，通過(guò)招募RNase-H的機(jī)制主要是利用RNase-H，切割A(yù)SO-mRNA，使mRNA被裂解；而另一類不招募RNase-H的作用機(jī)制，主要是通過(guò)ASO與mRNA緊密結(jié)合，使得mRNA抑制翻譯和轉(zhuǎn)錄，作用機(jī)制見(jiàn)下圖1；了解了我們的目標(biāo)機(jī)制，我們還需要了解目標(biāo)對(duì)象是什么？目標(biāo)基因是什么-外顯子，間隔子還是其他？
第二步：設(shè)計(jì)8~10個(gè)ASO序列，在設(shè)計(jì)ASO序列時(shí)，需要考慮的因素：①確定某些序列是否會(huì)加強(qiáng)或減弱ASO的活性；②G/C的含量：大于55%的G/C的含量會(huì)增強(qiáng)ASO的結(jié)合力；③可以通過(guò)計(jì)算模型來(lái)設(shè)計(jì)ASO；④確保序列能夠識(shí)別的是唯一基因；理想的ASO是有大于3個(gè)堿基與其他基因無(wú)法匹配；
第三步：確保是否可以購(gòu)買(mǎi)到合適的單體用于制備ASO；比如：對(duì)于需要招募RNase-H，可以采用PS修飾；對(duì)于不需要招募RNase-H，可以采用PS修飾或PMO修飾；對(duì)于招募RNase-H機(jī)制，可以對(duì)前5個(gè)和后5個(gè)堿基進(jìn)行2'位置進(jìn)行修飾，對(duì)于非招募RNase-H的藥物，可以對(duì)所有堿基進(jìn)行2'位置進(jìn)行修飾；
第四步：通過(guò)適當(dāng)?shù)捏w外細(xì)胞研究，篩選8~10個(gè)ASO；確?；蚰軌蛟诩?xì)胞中被表達(dá)；使用6~200nM濃度的ASO進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，收集24h的mRNA并分析它的有效性，選擇4~5個(gè)有效的ASO進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)；
第五步：在體內(nèi)模型篩選合適的ASO，確保目標(biāo)ASO能夠在小鼠/小鼠細(xì)胞中表達(dá)；
第六步：選擇最佳的ASO進(jìn)行藥效研究，確定ASO的有效劑量。
圖1 ASO的作用機(jī)制[1]
序列設(shè)計(jì)思路[1]
合成過(guò)程的研發(fā)要點(diǎn)
核苷單體合成的要點(diǎn)
小核酸藥物的關(guān)鍵原料為核苷單體，如圖2所示，DNA的亞磷酰胺單體主要是由堿基、脫氧核糖、5'-DMT和3'端的2-氰乙基以及二異丙胺基組成；而RNA的亞磷酰胺單體在DNA的亞磷酰胺單體的基礎(chǔ)上，需要對(duì)2'-OH進(jìn)行保護(hù)，該保護(hù)基團(tuán)一般為T(mén)BDMS（叔丁基二甲基硅基）；此外，由于腺嘌呤，鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶上存在伯胺基，因此也需要一定的基團(tuán)保護(hù)，通常用作這些氨基保護(hù)基的是?；绫郊柞；˙z），乙?；ˋc），異丁?；?；然而，對(duì)于該步驟中，最關(guān)鍵的
主要有三個(gè)，第一個(gè)是進(jìn)行必要的化學(xué)修飾，采用何種化學(xué)修飾將會(huì)影響最終的核酸藥物的成藥性、以及藥物的酶抗性；目前常見(jiàn)的修飾方法主要有，磷酸骨架的修飾（比如PS）、2'位羥基核糖的修飾(比如：2’-O-甲基修飾，2’-O-甲氧乙基修飾（2’-MOE），氟（F）等取代），核糖五元環(huán)骨架修飾（比如：LNA，PMO等）；第二個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：核苷單體的質(zhì)量控制，由于核苷單體合成技術(shù)環(huán)節(jié)眾多，同時(shí)核苷單體經(jīng)過(guò)各種修飾，結(jié)構(gòu)也變得更加復(fù)雜多變，雜質(zhì)團(tuán)的種類也變得更加繁多，因此在質(zhì)量控制上也是具有極大的挑戰(zhàn)；通常情況下，亞磷酰胺單體的純度要求一般≥99.0%，下圖3是某單體質(zhì)量要求的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求；第三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：由于市場(chǎng)目前處于早期，要使單體投入生產(chǎn)領(lǐng)域其成本較高，特別是要想獲得比較大的生產(chǎn)量，也是較大的挑戰(zhàn)之一。
圖2 亞磷酰胺單體結(jié)構(gòu)式[2]
圖3 單體的檢測(cè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[3]
序列合成的挑戰(zhàn)
單體合成后，需要進(jìn)行下一步，對(duì)其序列進(jìn)行合成純化，工業(yè)上合成純化方法主要包括：化學(xué)合成法、RNA酶解法、微生物發(fā)酵法及生物催化法，其中化學(xué)合成主要方法又包括反相色譜法（固相合成—反相色譜純化—脫三苯甲基化—乙醇沉淀法等—凍干）、離子交換層析法（固相合成—離子交換層析—濃縮/深層過(guò)濾—凍干）、疏水層析結(jié)合離子交換層析（固相合成—疏水層析—脫三苯甲基化—離子交換—UF/DF—原料藥溶液）；目前已上市的核酸藥物大多采用化學(xué)合成法中反向色譜法和離子交換層析法，該方法的具體步驟包括去DMT（脫三苯甲基）保護(hù)、偶聯(lián)、氧化、加帽，循環(huán)（見(jiàn)下圖4）達(dá)到所需要的序列長(zhǎng)度后，再進(jìn)行裂解和脫保護(hù)（Cleavage and Deprotection，C&D），最終得到我們所需要的序列；然而，在這一過(guò)程中，若工藝參數(shù)控制不好很有可能會(huì)產(chǎn)生一系列的雜質(zhì)，包括產(chǎn)生N-X序列如N-1，N+X的序列（longmer sequences）如N+G，硫代磷酸酯鍵（PS）產(chǎn)生的非對(duì)映異構(gòu)體和氧化產(chǎn)生PO雜質(zhì)，胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶脫氨基引起的雜質(zhì)，其他雜質(zhì)如堿基脫嘌呤雜質(zhì)，2'-5'連接異構(gòu)雜質(zhì)，序列異構(gòu)體等。
圖4 寡核苷酸合成路線圖[4]
N-X序列（shortmer sequences），如N-1的產(chǎn)生主要原因包括：①脫保護(hù)時(shí)間的長(zhǎng)短，以及脫保護(hù)劑的酸堿性，脫保護(hù)反應(yīng)時(shí)間不夠/脫保護(hù)劑酸性太弱會(huì)產(chǎn)生N-1雜質(zhì)；而脫保護(hù)時(shí)間又取決于流速和柱子的尺寸；②空間位阻導(dǎo)致脫保護(hù)劑脫離效率低產(chǎn)生N-1的雜質(zhì)；
N+X的序列（longmer sequences），如N+G，N+A的產(chǎn)生主要原因包括：①脫保護(hù)試劑沖洗不干凈導(dǎo)致N+1雜質(zhì)的產(chǎn)生；②亞磷酰胺單體自身形成二聚體，然后與5'-OH反應(yīng)；③新加入的亞磷酰胺單體被偶聯(lián)兩次；
硫代磷酸酯鍵（PS）產(chǎn)生的非對(duì)映異構(gòu)體和氧化產(chǎn)生PO雜質(zhì)主要原因：在氧化過(guò)程中，使用的氧化試劑可以將已形成的PS鍵氧化為PO鍵；
胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶脫氨基引起的雜質(zhì)：在斷裂和脫保護(hù)過(guò)程中，甲胺與胞苷殘基（被苯甲?；Ｗo(hù)）反應(yīng)形成N-4-甲基胞苷雜質(zhì)。
由此可見(jiàn)，序列合成過(guò)程中主要有以下幾個(gè)關(guān)鍵要點(diǎn)，第一：合成工藝，工藝參數(shù)以及試劑的質(zhì)量將會(huì)影響藥物的質(zhì)量，比如：柱子使用尺寸、流速、脫保劑的酸堿度等等。第二：核酸原料藥生產(chǎn)使用固相合成技術(shù)，其在工藝放大和質(zhì)量控制上存在較高壁壘；第三：核酸原料藥固相合成配套設(shè)備、潔凈環(huán)境等前期投入非常大；
質(zhì)量控制的挑戰(zhàn)
由于小核酸藥物處于早期，目前無(wú)明確的法規(guī)對(duì)其進(jìn)行指導(dǎo)，2021年FDA[5]發(fā)布關(guān)于反義寡核苷酸藥物的化學(xué)、生產(chǎn)控制指南中提出；對(duì)于原料藥，F(xiàn)DA推薦采用兩種方法進(jìn)行鑒別，鑒別包括：分子量及序列，其他方法包括熔點(diǎn)（Tm）、液相保留時(shí)間；原料質(zhì)量研究?jī)?nèi)容包括：序列（質(zhì)譜分析）、熔點(diǎn)（Tm）、成鹽形式、殘留溶劑、水分、微生物檢測(cè)、細(xì)菌內(nèi)毒素、雜質(zhì)個(gè)數(shù)、特定雜質(zhì)含量、總雜、元素雜質(zhì)、重金屬等等；
關(guān)于雜質(zhì)限度的制定，暫無(wú)明確的法規(guī)進(jìn)行參考，根據(jù)OSWG白皮書(shū)[6]第10章關(guān)于寡核苷酸藥物中雜質(zhì)中指出，建議鑒定限為1.0%，界定限為1.5%；文章給出制定該標(biāo)準(zhǔn)的理由有三點(diǎn)：第一：寡核苷酸藥物的新雜質(zhì)或未知雜質(zhì)的大部分來(lái)源于合成，而這些雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)很可能與目標(biāo)化合物相似，它們的化學(xué)性質(zhì)也有可能與目標(biāo)化合物相似，比如水溶性、與蛋白結(jié)合力、分子量等；第二：由于寡核苷酸藥物的分子量與小分子的分子量差異很大，比如，小分子的分子量大概為500Da，而寡核苷酸藥物的分子量可能要達(dá)到5000Da，它們的分子量相差10倍，因此，在相同的臨床劑量下，由于分子量的差異，寡核苷酸的雜質(zhì)水平為1.0%與小分子藥物0.1%的數(shù)量相當(dāng)；第三：根據(jù)現(xiàn)有的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，無(wú)法證明寡核苷酸藥物的毒性是來(lái)源于雜質(zhì)。同時(shí)文章中，還給出了關(guān)于寡核苷酸藥物雜質(zhì)鑒定決策樹(shù)（詳見(jiàn)下圖5）；具體報(bào)告限或鑒定限(小分子化藥與OSWG白皮書(shū))對(duì)比表。
圖5寡核苷酸藥物雜質(zhì)鑒定決策樹(shù)[6]
對(duì)于小核酸藥物藥物分析中還存在一個(gè)很重要的要點(diǎn)，那就是雜質(zhì)分析方法的開(kāi)發(fā)，由于在化學(xué)合成過(guò)程中，很容易產(chǎn)生n-1的雜質(zhì)，該雜質(zhì)通常比母體少一個(gè)堿基，因此它的的化學(xué)性質(zhì)與目標(biāo)化合物也是非常相似的，這就容易造成分離的困難，特別是對(duì)于較長(zhǎng)序列的藥物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，序列越長(zhǎng)，雜質(zhì)越難被分離。在早期，人們是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，通過(guò)UV來(lái)檢測(cè)；1980年，主要采用CGE分離不同長(zhǎng)度的序列，這個(gè)方法主要是在聚丙烯酰胺凝膠電泳的基礎(chǔ)上，填加了毛細(xì)管，從而提高理論塔板數(shù)；陰離子交換（AEX）HPLC后來(lái)被廣泛應(yīng)用，主要是用來(lái)定量分析硫磷二酯中的PO雜質(zhì)；最近，離子對(duì)（IP）HPLC技術(shù)流行開(kāi)來(lái)，在很多情況下，已經(jīng)替代了CGE方法，用于分離不同長(zhǎng)度序列的雜質(zhì)；近年來(lái)，ESI-MS和IP-HPLC-ESI-MS技術(shù)被廣泛使用。
表2 雙鏈寡核苷酸活性成分的檢測(cè)項(xiàng)目和分析方法[7]
表3 單鏈寡核苷酸活性成分的檢測(cè)項(xiàng)目和分析方法[7]
遞送系統(tǒng)的挑戰(zhàn)
遞送系統(tǒng)是小核酸藥物研究的重點(diǎn)項(xiàng)目之一，遞送系統(tǒng)關(guān)系到藥物的安全性和有效性，對(duì)于不同疾病不同藥物類型可能千變?nèi)f化；目前已上市siRNA的產(chǎn)品均采用遞送系統(tǒng)，而目前已上市的ASO未采用遞送,但最終是否需采用遞送系統(tǒng)還是要考慮眾多因素；①作用靶點(diǎn)在哪些位置，腦部？肝？肺？肌肉組織？；②注射途徑是什么？③風(fēng)險(xiǎn)與收益的平衡；
比如海昶生物對(duì)治療原發(fā)性腎癌的HC0201進(jìn)行了納米脂質(zhì)體優(yōu)化，形成了差異化創(chuàng)新的抗原發(fā)性肝癌藥物HC0301，兩者為同一核酸API Mychexin；HC0201通過(guò)納米脂質(zhì)體技術(shù)，使它的穩(wěn)定性和生物分布得到更佳的優(yōu)化，同時(shí)對(duì)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境還有一些靶向的作用,通過(guò)遞送系統(tǒng)，使藥物精準(zhǔn)作用肝臟，因此用于肝癌，而未采用遞送系統(tǒng)則是用于治療原發(fā)性腎癌。
又比如針對(duì)治療阿爾茨海默?。ˋD）和腦淀粉樣血管?。–AA）等疾病，這些疾病的病變部位主要是腦部，因此目前較為成熟的遞送手段LNP和GalNAc修飾手段，主要遞送至肝臟，無(wú)法達(dá)到腦部；Alnylam Pharmaceuticals所開(kāi)發(fā)的C16偶聯(lián)技術(shù)經(jīng)過(guò)優(yōu)化，使得能夠到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織，在今年10月底，針對(duì)治療阿爾茨海默?。ˋD）和腦淀粉樣血管?。–AA），Alnylam公布了在研的ALN-APP產(chǎn)品，目前該產(chǎn)品臨床1期試驗(yàn)的中期結(jié)果獲得了積極效果。結(jié)果顯示，單劑ALN-APP的持續(xù)藥代動(dòng)力學(xué)活性可以長(zhǎng)達(dá)10個(gè)月，同時(shí)觀察到與AD和CAA相關(guān)的淀樣蛋白片段Aβ42和Aβ40的顯著降低。
比如已上市的Golodirsen，主要是用于治療杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，該產(chǎn)品主要是通過(guò)PMO修飾，并未使用遞送系統(tǒng)，抗肌萎縮蛋白是一種細(xì)胞骨架蛋白主要布于心肌和骨豁肌肌纖維膜的胞質(zhì)，最主要是分布在神經(jīng)肌肉接頭處，而被修飾后的Golodirsen，通過(guò)靜脈注射，藥物可以與血漿蛋白結(jié)合，自動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而該蛋白是處于心肌與骨骼肌纖維膜的胞質(zhì)中，即藥物僅進(jìn)入外周組織即可達(dá)到效果。
圖片來(lái)源于海昶生物官網(wǎng)
ALN-APP顯著降低腦脊液中的Aβ42和Aβ40水平（圖片來(lái)源：Alnylam官網(wǎng)）
總結(jié)：
一個(gè)藥物被成功開(kāi)發(fā)，最終走上市場(chǎng)需要經(jīng)歷千錘百練，需要考慮的因素也是非常眾多；對(duì)于小核酸藥物CMC的研發(fā)要點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止于此，在這里僅僅是粗略談?wù)摿诵蛄械脑O(shè)計(jì)思路、合成的研發(fā)要點(diǎn)、質(zhì)量控制的研發(fā)要點(diǎn)、以及遞送系統(tǒng)需要考慮的要點(diǎn)。
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