摘要 目的：為完善亞硝胺雜質(zhì)的科學(xué)監(jiān)管及制藥企業(yè)建立亞硝胺雜質(zhì)的控制策略提供參考。方法：通過(guò)梳理中國(guó)、美國(guó)和歐盟關(guān)于亞硝胺雜質(zhì)的監(jiān)管及控制要求，進(jìn)一步探討亞硝胺雜質(zhì)的來(lái)源、質(zhì)量控制及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。結(jié)果與結(jié)論：自2018年在沙坦類等藥物中檢出不可接受水平的亞硝胺雜質(zhì)以來(lái)，國(guó)內(nèi)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)相繼開(kāi)展了化學(xué)藥物中亞硝胺雜質(zhì)的調(diào)查并發(fā)布相關(guān)控制措施以降低風(fēng)險(xiǎn)。亞硝胺雜質(zhì)屬于ICHM7（R1）中提及的“關(guān)注隊(duì)列”物質(zhì)，可以通過(guò)多種途徑引入到化學(xué)藥物或藥物自身降解產(chǎn)生，實(shí)現(xiàn)對(duì)亞硝胺雜質(zhì)的有效控制，對(duì)于保證藥品的安全及質(zhì)量可控至關(guān)重要。
亞硝胺雜質(zhì)是一類分子中含有N-亞硝基結(jié)構(gòu)的化合物，不同于藥物中的大多數(shù)有機(jī)雜質(zhì)，亞硝胺雜質(zhì)在極低暴露量的情形下具有高度致癌性，國(guó)際人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）M7（R1）《評(píng)估和控制藥物中DNA反應(yīng)性（致突變）雜質(zhì)以限制潛在致癌風(fēng)險(xiǎn)》指南明確亞硝胺雜質(zhì)為“關(guān)注隊(duì)列”物質(zhì)[1]，世界衛(wèi)生組織公布的致癌物清單中N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）均屬于2A類致癌物質(zhì)[2]。2018年在纈沙坦類藥品檢出了亞硝胺雜質(zhì)NDMA，經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)其他沙坦類藥品中也存在NDMA、NDEA等亞硝胺雜質(zhì)，隨后雷尼替丁、二甲雙胍等非沙坦類藥品中亦發(fā)現(xiàn)不可接受水平的亞硝胺雜質(zhì)。
具有高致癌性的亞硝胺雜質(zhì)引起了全球監(jiān)管機(jī)構(gòu)的共同關(guān)注，歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）于2018年7月啟動(dòng)纈沙坦藥品中亞硝胺雜質(zhì)的評(píng)估，同年9月啟動(dòng)對(duì)沙坦類藥物（坎地沙坦、厄貝沙坦、氯沙坦、奧美沙坦和纈沙坦）亞硝胺雜質(zhì)的調(diào)查，2019年對(duì)非沙坦類藥品吡格列酮和雷尼替丁檢出亞硝胺雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)估，2020年6月EMA發(fā)布《人用藥中的亞硝胺雜質(zhì)評(píng)估報(bào)告》[3]。2018年6月美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）收到纈沙坦藥物中檢出 NDMA 雜質(zhì)的通知并啟動(dòng)調(diào)查，2019年9月雷尼替丁和尼扎替丁檢出NDMA雜質(zhì)，2020年4月FDA要求從美國(guó)市場(chǎng)上召回所有雷尼替丁藥品，2020年5月召回NDMA超限的二甲雙胍緩釋制劑，2020年9月FDA發(fā)布《人用藥物中亞硝胺雜質(zhì)的控制》行業(yè)指南[4]，闡述了亞硝胺雜質(zhì)的可能引入條件及控制要求等。2023年8月FDA發(fā)布關(guān)于《亞硝胺藥物成分相關(guān)雜質(zhì)的推薦可接受攝入量限度》指南，用于已批準(zhǔn)上市的藥品以及在審產(chǎn)品可能存在的亞硝胺藥物成分相關(guān)雜質(zhì)（Nitrosamine Drug Substance-related Impurities，NDSRIs）進(jìn)行基于風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估[5]。
國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心于2019年1月公開(kāi)征求《關(guān)于在原料藥工藝中生成亞硝胺類化合物的風(fēng)險(xiǎn)警示》意見(jiàn)的通知[6]，2020年5月發(fā)布《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[7]，2023年3月發(fā)布的《化學(xué)藥品創(chuàng)新藥Ⅲ期臨床試驗(yàn)前會(huì)議藥學(xué)共性問(wèn)題及相關(guān)技術(shù)要求（試行）》明確要求亞硝胺類雜質(zhì)需按相關(guān)要求進(jìn)行評(píng)估研究和控制[8]。實(shí)現(xiàn)對(duì)亞硝胺雜質(zhì)的有效控制，對(duì)于保證藥品的安全及質(zhì)量可控至關(guān)重要。本文將結(jié)合歐盟、美國(guó)和我國(guó)實(shí)施的亞硝胺雜質(zhì)監(jiān)管措施及相關(guān)法規(guī)要求，從亞硝胺雜質(zhì)的來(lái)源、質(zhì)量控制、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等方面進(jìn)行分析探討，為完善亞硝胺雜質(zhì)的科學(xué)監(jiān)管及制藥企業(yè)建立亞硝胺雜質(zhì)的控制策略提供參考。
1、 國(guó)內(nèi)外亞硝胺雜質(zhì)的監(jiān)管
1.1 歐盟
EMA于2020年6月發(fā)布《人用藥中的亞硝胺雜質(zhì)評(píng)估報(bào)告》，該指南對(duì)亞硝胺雜質(zhì)的生成機(jī)理、雜質(zhì)限度制定依據(jù)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等進(jìn)行了詳盡闡述，全文基于行業(yè)現(xiàn)狀及專家意見(jiàn)開(kāi)展了亞硝胺雜質(zhì)的全面調(diào)研及科學(xué)評(píng)估，最終形成亞硝胺雜質(zhì)的來(lái)源、雜質(zhì)限度及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估策略要求[3]。
指南指出生產(chǎn)商應(yīng)對(duì)原料藥的合成路線、起始物料、中間體、原材料（溶劑、試劑、催化劑等）和制劑的生產(chǎn)過(guò)程（包括原輔料、包裝等）進(jìn)行評(píng)估，以確認(rèn)亞硝胺雜質(zhì)產(chǎn)生的根本原因并降低風(fēng)險(xiǎn)。如果確認(rèn)存在引入或產(chǎn)生亞硝胺風(fēng)險(xiǎn)，則應(yīng)考慮改變生產(chǎn)工藝；若風(fēng)險(xiǎn)無(wú)法避免則應(yīng)對(duì)原料藥或制劑制定合理的控制策略。對(duì)于申報(bào)上市及指定需要評(píng)估的品種，申報(bào)資料需提交亞硝胺風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告，如果具有潛在亞硝胺雜質(zhì)出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)，則應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行確認(rèn)性檢驗(yàn)。同時(shí)說(shuō)明如對(duì)檢出的亞硝胺雜質(zhì)有足夠深入的研究或其檢出水平始終低于要求限值的10%，可不定入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制。
1.2 美國(guó)
FDA于2020年9月發(fā)布《人用藥物中亞硝胺雜質(zhì)的控制》行業(yè)指南，闡述了亞硝胺雜質(zhì)的可能引入條件，并建議原料藥和制劑生產(chǎn)商對(duì)已批準(zhǔn)或上市銷售的產(chǎn)品以及在審產(chǎn)品進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，采取適當(dāng)措施減少或防止亞硝胺雜質(zhì)產(chǎn)生[4]。
該指南指出在酸性條件下，仲胺、叔胺或季胺類化合物和亞硝酸鹽可能形成亞硝胺雜質(zhì)。例如在仲胺存在的情況下使用亞硝酸淬滅殘留的疊氮化物（合成四唑環(huán)或引入疊氮基團(tuán)的常用試劑），則形成亞硝胺的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)更高。其次，生產(chǎn)商應(yīng)評(píng)估含有胺基的試劑是否有形成亞硝胺的潛在風(fēng)險(xiǎn)，例如在高溫條件下反應(yīng)較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)，N,N-二甲基甲酰胺可能降解為二甲胺，二甲胺可與亞硝酸反應(yīng)形成NDMA；N-甲基吡咯烷酮、N,N-二甲基乙酰胺和N,N-二乙基乙酰胺亦有類似的降解途徑。同時(shí)指出外購(gòu)起始物料或原輔料也存在亞硝胺污染的風(fēng)險(xiǎn)，使用回收的溶劑、催化劑和試劑也可能導(dǎo)致亞硝胺形成。對(duì)于采用亞硝酸淬滅疊氮化物的反應(yīng)，如果沒(méi)有足夠的清除或精制操作，亞硝胺雜質(zhì)可能會(huì)被帶入至后續(xù)步驟，增加亞硝胺雜質(zhì)的存在風(fēng)險(xiǎn)。另外說(shuō)明某些藥物本身會(huì)降解產(chǎn)生亞硝胺類雜質(zhì)，例如雷尼替丁藥品中 NDMA 檢出量會(huì)隨著穩(wěn)定性貯藏時(shí)間的推移升高至不可接受的水平。FDA建議生產(chǎn)商研究亞硝胺雜質(zhì)形成的潛在原因，評(píng)估其原料藥和制劑中亞硝胺雜質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn)。
2021年2月FDA更新了指南，該指南重新制定了制藥商完成亞硝胺雜質(zhì)評(píng)估的時(shí)間表。2021年11月發(fā)布了《降低藥品中亞硝胺藥物成分相關(guān)雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)的緩解策略》[9]，擬向行業(yè)提供可能的控制策略，以降低藥品的NDSRIs風(fēng)險(xiǎn)。NDSRIs 是一類與原料藥具有相似結(jié)構(gòu)的亞硝胺雜質(zhì)，在某些情況將NDSRIs的形成歸因于輔料中的亞硝酸鹽雜質(zhì)。FDA建議生產(chǎn)商制定合理的控制策略并與監(jiān)管部門聯(lián)系，可通過(guò)在處方中添加抗氧化劑抑制成品中NDSRIs 的形成，或采用輔料（如碳酸鈉）將pH 值調(diào)至中性或堿性以抑制 NDSRIs 的形成等。
2023年8月FDA發(fā)布了《亞硝胺藥物成分相關(guān)雜質(zhì)的推薦可接受攝入量限度》指南，用于預(yù)測(cè)藥品中可能存在NDSRIs的致突變和致癌性，提供其可接受攝入量限度，并給出了完成實(shí)施時(shí)間表。指南指出NDSRIs 通常由含有仲胺或叔胺的原料藥與亞硝化試劑（例如制劑輔料中殘留的亞硝酸鹽）發(fā)生亞硝化反應(yīng)而形成，該雜質(zhì)在藥品生產(chǎn)過(guò)程或貯存期間均可產(chǎn)生。由于目前缺乏可以確定NDSRIs限度的致癌和致突變性數(shù)據(jù)，指南提供了基于NDSRIs 結(jié)構(gòu)特征來(lái)預(yù)測(cè)其致癌性的5種分類，并推薦相應(yīng)的可接受攝入限度（依次為26.5、100、400、1500、1500 ng·d-1），此方法適用于亞硝基兩側(cè)均有碳原子的NDSRIs，并且碳原子不直接與雜原子雙鍵鍵合（例如亞硝酰胺、亞硝基脲等），不適用于亞硝基在芳環(huán)內(nèi)的 NDSRIs（例如亞硝基吲哚）。FDA建議申請(qǐng)人應(yīng)在指南發(fā)布后的3個(gè)月內(nèi)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，如果確認(rèn)檢出的NDSRIs高于可接受攝入量限度應(yīng)及時(shí)通知FDA[5]。
1.3 中國(guó)
國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心2020年5月發(fā)布《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，指南闡述了亞硝胺雜質(zhì)的產(chǎn)生途徑：（1）由生產(chǎn)工藝引入，在一定條件下，胺類化合物尤其是仲胺，與亞硝酸鈉（NaNO2）或其他亞硝化試劑反應(yīng)產(chǎn)生亞硝胺類雜質(zhì)。仲胺可能來(lái)源于物料本身，或由伯胺、叔胺及季銨引入；酰胺類溶劑（如N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等）在適宜的條件下（如酸性、高溫等）也可能產(chǎn)生仲胺。亞硝化試劑的可能來(lái)源包括亞硝酸鹽、亞硝酸酯、亞硝酸、由亞硝酸鹽制備的物質(zhì)（例如疊氮化鈉等），及胺類化合物的氧化等。（2）由污染引入，原料藥生產(chǎn)過(guò)程中使用了被亞硝胺類雜質(zhì)污染的物料（起始物料、中間體、溶劑、試劑、催化劑等）；被亞硝胺污染的回收物料；同一生產(chǎn)線交叉污染引入的亞硝胺類雜質(zhì)。（3）降解產(chǎn)生，藥物本身降解產(chǎn)生亞硝胺類雜質(zhì)（例如雷尼替丁在高溫下會(huì)產(chǎn)生亞硝胺類雜質(zhì)）[7]。
該指南明確藥品上市許可持有人/藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)切實(shí)履行藥品質(zhì)量管理的主體責(zé)任，對(duì)藥品的安全和質(zhì)量進(jìn)行全生命周期管理，盡可能從原料藥工藝路線的選擇、物料的選擇與質(zhì)控、工藝條件的優(yōu)化等方面盡量避免亞硝胺類雜質(zhì)的引入，若評(píng)估藥品具有亞硝胺類雜質(zhì)殘留風(fēng)險(xiǎn)且相關(guān)工藝無(wú)法避免時(shí)，應(yīng)盡可能將該步驟調(diào)整至工藝的早期，利用后續(xù)多步驟的操作降低亞硝胺類雜質(zhì)殘留風(fēng)險(xiǎn)，并建立合適的分析方法，確保亞硝胺類雜質(zhì)水平控制在安全限度以下。
2、 亞硝胺雜質(zhì)的控制
2.1 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
亞硝胺雜質(zhì)的產(chǎn)生途徑較多，為保證該類雜質(zhì)的有效控制及去除，需要充分評(píng)估原料藥和制劑成品中亞硝胺污染或形成的風(fēng)險(xiǎn)。
EMA《人用藥物中的亞硝胺雜質(zhì)評(píng)估報(bào)告》建議由生產(chǎn)商開(kāi)展亞硝胺雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，原料藥結(jié)合如下因素進(jìn)行分析：在仲胺、叔胺或季銨鹽，或與易降解為仲胺或叔胺的試劑、溶劑和催化劑存在的情形下，使用亞硝酸鈉或其他亞硝化劑；使用受污染的原材料或回收的溶劑、試劑和催化劑；使用受亞硝胺污染的起始物料或中間體；在同一產(chǎn)線生產(chǎn)的交叉污染；起始物料、中間體和原料藥的降解；泡罩包裝材料污染。對(duì)于制劑應(yīng)結(jié)合藥品生產(chǎn)過(guò)程中的交叉污染、輔料的亞硝胺污染風(fēng)險(xiǎn)、貯藏條件和包裝形式（泡罩包裝外使用硝化纖維）及其它降解途徑（亞硝胺雜質(zhì)降解為更小的亞硝胺雜質(zhì)）等方面進(jìn)行評(píng)估。另外說(shuō)明生物制品出現(xiàn)亞硝胺雜質(zhì)的整體風(fēng)險(xiǎn)雖然較低，但對(duì)于含有化學(xué)合成結(jié)構(gòu)的生物制品、使用了添加亞硝化試劑工藝的生物制品，或其內(nèi)包材使用含硝化纖維的泡罩包裝仍應(yīng)考慮亞硝胺雜質(zhì)的潛在風(fēng)險(xiǎn)[3]。
FDA《人用藥物中亞硝胺雜質(zhì)的控制》明確生產(chǎn)商需要對(duì)任何存在潛在亞硝胺雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)的藥品開(kāi)展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，提供了防止藥品中出現(xiàn)不可接受水平亞硝胺雜質(zhì)所需采取措施的建議。對(duì)于原料藥生產(chǎn)商應(yīng)進(jìn)行生產(chǎn)工藝的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，識(shí)別是否有可能存在亞硝胺雜質(zhì)。如果存在亞硝胺雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的高靈敏方法對(duì)批次樣品進(jìn)行確認(rèn)檢測(cè)，如果檢出任一種亞硝胺雜質(zhì)，生產(chǎn)商應(yīng)調(diào)查其根本原因并對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行變更，以降低或防止亞硝胺雜質(zhì)的產(chǎn)生。建議原料藥生產(chǎn)商盡可能避免可能產(chǎn)生亞硝胺雜質(zhì)的反應(yīng)條件；如果不能避免，要通過(guò)研究證明對(duì)工藝的合理控制，以降低亞硝胺雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)；對(duì)于酰胺類溶劑應(yīng)謹(jǐn)慎使用；采用其它試劑替代亞硝酸鹽進(jìn)行疊氮淬滅，或?qū)⑹褂茂B氮鹽反應(yīng)生成的原料或中間體從母液中分離至有機(jī)相，再分離至水相使用亞硝酸進(jìn)行淬滅。另建議生產(chǎn)商應(yīng)對(duì)原料藥的供應(yīng)鏈進(jìn)行審計(jì)，監(jiān)控潛在風(fēng)險(xiǎn)的起始物料和中間體。同時(shí)應(yīng)盡量避免在生產(chǎn)工藝中使用回收的溶劑、試劑和催化劑等。建議制劑生產(chǎn)商制定合理的控制策略，評(píng)估原料藥及成品的穩(wěn)定性樣品是否檢出潛在亞硝胺雜質(zhì)。如果檢出高于定量限（Limit of Quantitation，LOQ）的亞硝胺雜質(zhì)，生產(chǎn)商應(yīng)制訂控制策略以確保亞硝胺水平保持低于可接受限度，并對(duì)每個(gè)批次進(jìn)行放行檢測(cè)。同時(shí)應(yīng)向FDA提交用于防止或降低亞硝胺雜質(zhì)產(chǎn)生的變更報(bào)告[4]。
我國(guó)《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》規(guī)定對(duì)于申報(bào)上市的產(chǎn)品，申請(qǐng)人在研發(fā)中應(yīng)進(jìn)行亞硝胺類雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，對(duì)明確有亞硝胺類雜質(zhì)潛在風(fēng)險(xiǎn)的品種應(yīng)進(jìn)行充分的研究，在申報(bào)資料的相應(yīng)章節(jié)提交亞硝胺類雜質(zhì)的研究資料及檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)應(yīng)注意用于研究的樣品的批次、批量必須具有代表性以及科學(xué)依據(jù)。對(duì)于已上市藥品，藥品上市許可持有人/藥品生產(chǎn)企業(yè)也應(yīng)主動(dòng)對(duì)于亞硝胺類雜質(zhì)存在的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，若存在潛在的亞硝胺類雜質(zhì)產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)，可參照指導(dǎo)原則的要求進(jìn)行研究，根據(jù)研究結(jié)果采取相應(yīng)的措施，以防止或最小化患者亞硝胺類雜質(zhì)的暴露[7]。
2.2 分析方法
歐洲藥典（European Pharmacopoeia，EP）于2020年12月發(fā)布了亞硝胺通則（N-Nitrosamines in Active Substances）[10]，該通則提供了3種定量分析方法用于7個(gè)亞硝胺雜質(zhì)的測(cè)定：分別為方法A（液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，LC-MS/MS），方法B（氣相色譜-質(zhì)譜法，GC-MS）和方法C（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，GC-MS/MS），其中NDMA適用 A/B/C方法、NDEA適用 A/B/C方法、亞硝基二丁胺（NDBA）適用C方法、亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）適用 A方法、亞硝基-二異丙胺（NDIPA）適用 A/C方法、亞硝基乙基-異丙基胺（NEIPA）適用 A/C方法、亞硝基-二丙基胺（NDPA）適用C方法。同時(shí)說(shuō)明采用方法A，如果待測(cè)樣品含有二甲基甲酰胺（DMF）則可能會(huì)干擾NDMA的檢測(cè)。2021年2月纈沙坦、氯沙坦鉀、坎地沙坦酯、厄貝沙坦和奧美沙坦酯的各論均增加生產(chǎn)商應(yīng)開(kāi)展亞硝胺雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的規(guī)定，并要求實(shí)施控制策略進(jìn)行亞硝胺雜質(zhì)的檢測(cè)和控制[11-15]。
美國(guó)藥典（US Pharmacopeia，USP）通則<1469> Nitrosamine Impurities[16]于2021年12月正式實(shí)施，該通則為原料藥和制劑中潛存的亞硝胺雜質(zhì)的識(shí)別、評(píng)估提供了科學(xué)的方法，提供了4種分析方法用于7個(gè)亞硝胺雜質(zhì)的檢測(cè)，包括NDMA、NDEA、NDIPA、NEIPA、NDBA、N-亞硝基甲基苯胺（NMPA）和NMBA。通則指出為防止痕量級(jí)的亞硝胺雜質(zhì)在樣品處理過(guò)程中的損失，合適的樣品制備方法是亞硝胺雜質(zhì)分析的關(guān)鍵。第一種方法為高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜法（HPLCHRMS），推薦用于纈沙坦、厄貝沙坦和氯沙坦鉀的NDMA、NDEA、NDIPA、NEIPA、NMBA和NDBA測(cè)定，其中樣品采用甲醇稀釋并渦旋直至完全分散或溶解；第二種方法為GC-MS法，推薦用于纈沙坦、厄貝沙坦、氯沙坦鉀、奧美沙坦酯、坎地沙坦酯和替米沙坦的NDMA、NDEA、NDIPA和NEIPA測(cè)定，樣品采用咪唑溶解后加入乙腈；第三種方法為HPLC-MS/MS法，推薦用于纈沙坦、氯沙坦鉀、奧美沙坦酯、坎地沙坦酯和替米沙坦的NDMA、NDEA、NDIPA、NEIPA、NMBA和NDBA測(cè)定，樣品采用1%甲酸水溶液溶解；第四種方法為GC-MS/MS法，推薦用于纈沙坦、氯沙坦鉀和坎地沙坦酯的NDMA、NDEA、NDIPA、NEIPA和NDMA，樣品采用二氯甲烷進(jìn)行提取。另外通則明確定量分析方法的驗(yàn)證應(yīng)包括線性范圍、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、中間精密度和定量限等。
目前，《中華人民共和國(guó)藥典》（Chinese Pharmacopeia，ChP）2020年版增加了《遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則》[17]，并且6個(gè)沙坦類品種（纈沙坦、替米沙坦、氯沙坦鉀、厄貝沙坦、坎地沙坦酯及阿利沙坦酯）原料藥標(biāo)準(zhǔn)增訂【生產(chǎn)要求】項(xiàng)[18]，規(guī)定應(yīng)對(duì)生產(chǎn)工藝等進(jìn)行評(píng)估以確定形成遺傳毒性雜質(zhì)NDMA、NDEA等的可能性，必要時(shí)，應(yīng)采用適宜的分析方法對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行分析，以確認(rèn)NDMA、NDEA等的含量符合我國(guó)藥品監(jiān)管部門相關(guān)指導(dǎo)原則或ICH M7指導(dǎo)原則要求。《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》規(guī)定亞硝胺類雜質(zhì)的分析測(cè)試方法，可以參考權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)布的方法，亦可自行開(kāi)發(fā)方法，均需注意分析方法靈敏度應(yīng)與所論證的雜質(zhì)限度相匹配，并采用雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行完整的方法學(xué)驗(yàn)證，保證亞硝胺類雜質(zhì)能夠準(zhǔn)確有效地檢出。若采用自行開(kāi)發(fā)方法，需證明該方法等效于或者更優(yōu)于同品種官方公布的方法。
2.3 控制限度
由于亞硝胺雜質(zhì)致癌機(jī)制尚不完全明確、同時(shí)缺乏可靠的人體致癌性數(shù)據(jù)，其致癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及可接受攝入量（Acceptable Intake，AI）的確定較為復(fù)雜?，F(xiàn)各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)均根據(jù)ICH M7（R1），使用TD50值（Median Toxic Dose，導(dǎo)致50%腫瘤發(fā)生率的給藥劑量）線性外推來(lái)計(jì)算AI，設(shè)定可接受風(fēng)險(xiǎn)控制水平對(duì)應(yīng)腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)為十萬(wàn)分之一，人體體重統(tǒng)一按50 kg計(jì)算，AI=TD50（mg·kg-1·d-1）×50 kg/50000，亞硝胺雜質(zhì)的限度=AI/每日最大用藥量。EMA《人用藥物中的亞硝胺雜質(zhì)評(píng)估報(bào)告》指出如檢出的亞硝胺雜質(zhì)沒(méi)有足夠的數(shù)據(jù)按ICH M7（R1）建議的情況，可使用18 ng·d-1作為毒理學(xué)關(guān)注閾值（Threshold of Toxicological Concern，TTC）用于雜質(zhì)限度的制定[3]。
EMA《人用藥物中的亞硝胺雜質(zhì)評(píng)估報(bào)告》明確NDMA 和 NMBA 的可接受攝入量為 96 ng·d-1，N D E A 、1 - 亞硝基- 4 - 甲基哌嗪（ M e N P ） 、NDBA、EIPNA 和 DIPNA 的可接受攝入量均為26.5ng·d-1[3]。2022年更新的《關(guān)于人用藥物中的亞硝胺雜質(zhì)的問(wèn)答指南》[19]中提出亞硝胺雜質(zhì)NDPA的每日可接受攝入值不超過(guò) 26.5 ng；同時(shí)明確對(duì)于檢出多個(gè)亞硝胺雜質(zhì)的限度計(jì)算提供了2種方法，第1種按照已知亞硝胺雜質(zhì)的每日攝入總量進(jìn)行計(jì)算（應(yīng)低于已知活性最強(qiáng)的亞硝胺雜質(zhì)可接受攝入限度）；第2種方法可以根據(jù) ICH M7（R1）指南確保所有檢出的亞硝胺雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)水平總和不超過(guò)十萬(wàn)分之一終生風(fēng)險(xiǎn)。2023年7月該問(wèn)答指南將MeNP限度調(diào)整為400 ng/天，并且新增了亞硝胺雜質(zhì)控制決策樹(shù)，以及NDSRIs雜質(zhì)的可接受攝入量限度計(jì)算方法（與FDA相關(guān)方法基本一致），同時(shí)說(shuō)明結(jié)合FDA指南對(duì)于NDMA、NDSRIs等雜質(zhì)建議采用加強(qiáng)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Bacterial Mutagenicity Assay，Ames）的測(cè)試條件，如果試驗(yàn)產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果，則無(wú)需開(kāi)展增強(qiáng)測(cè)試條件的Ames試驗(yàn)。
FDA《人用藥物中亞硝胺雜質(zhì)的控制》明確7個(gè)潛在的亞硝胺雜質(zhì)NDMA、NDEA、NMBA、N-亞硝基異丙基乙胺（NIPEA）、NDIPA、NDBA、N M P A，其中5 個(gè)（N D M A 、N D E A、N M B A、NIPEA、NMPA）已在原料藥或制劑中檢出。FDA建議亞硝胺雜質(zhì)NDMA、NDEA、NMBA、NMPA、NIPEA和NDIPA的可接受攝入量分別為96、26.5、96、26.5、26.5、26.5 ng·d-1。指南明確上述亞硝胺雜質(zhì)限值只適用于藥品中的單一雜質(zhì)，如含有多個(gè)亞硝胺雜質(zhì)，需根據(jù)每日最大劑量（Maximum Daily Dose，MDD）進(jìn)行計(jì)算，MDD低于880 mg·d-1的藥物，其亞硝胺雜質(zhì)總量不超過(guò)26.5 ng·d-1可被接受，對(duì)于MDD高于880 mg·d-1的藥物，亞硝胺雜質(zhì)總量應(yīng)控制為不超過(guò)26.5 ng·d-1，若不符合該要求應(yīng)與FDA進(jìn)行聯(lián)系。如果在藥品中發(fā)現(xiàn)未公布AI限值的亞硝胺雜質(zhì)，生產(chǎn)商應(yīng)依據(jù) ICH M7（R1）以確定亞硝胺相關(guān)雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)，并對(duì)擬定限值的可接受性與FDA溝通[4]。
我國(guó)《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》顯示NDMA目前可接受攝入量為96 ng·d-1，另說(shuō)明對(duì)于未能在權(quán)威機(jī)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢到TD50值時(shí)，可選用以下幾種方法分別獲得該亞硝胺類雜質(zhì)的控制限度，并建議取其中最小值：（1）可以參考國(guó)際權(quán)威機(jī)構(gòu)，如WHO、國(guó)際化學(xué)品安全性方案（International Programme on Chemical Safety，IPCS）等公布的數(shù)據(jù)或建立的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法；（2）與已有TD50值的亞硝胺類雜質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，可以導(dǎo)用其TD50值計(jì)算雜質(zhì)限度。例如N-亞硝基二異丙胺（DIPNA）和N-亞硝基乙基異丙基胺（EIPNA），其AI值采用NDMA和NDEA的數(shù)據(jù)外推，擬定DIPNA、EIPNA的每日最大攝入量為26.5 ng·d-1[7]。
3、 亞硝胺雜質(zhì)控制的審評(píng)思考
國(guó)內(nèi)外藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)均已實(shí)施亞硝胺雜質(zhì)控制的法規(guī)要求并且監(jiān)管要求也在不斷更新，申請(qǐng)人需持續(xù)關(guān)注國(guó)內(nèi)外藥品監(jiān)管部門對(duì)亞硝胺雜質(zhì)的要求并開(kāi)展相關(guān)研究。目前，相關(guān)品種的申報(bào)資料基本提交了對(duì)于亞硝胺雜質(zhì)的研究報(bào)告，筆者在審評(píng)中發(fā)現(xiàn)部分制藥企業(yè)的亞硝胺雜質(zhì)分析僅將NDMA、NMBA作為目標(biāo)物，未提供全面的亞硝胺雜質(zhì)評(píng)估分析及控制策略，也未說(shuō)明該雜質(zhì)的分析方法建立依據(jù)等。
3.1 控制策略
亞硝胺雜質(zhì)引入途徑復(fù)雜，申請(qǐng)人需要深刻理解亞硝胺雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要性，以建立全面的亞硝胺雜質(zhì)控制策略。亞硝胺雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估應(yīng)結(jié)合原料藥的合成工藝、起始物料、溶劑試劑，同時(shí)避免使用受污染的原材料或回收材料；對(duì)于制劑采用同一條生產(chǎn)線應(yīng)防止交叉污染引入亞硝胺雜質(zhì)，藥品輔料和內(nèi)包材污染也是產(chǎn)生亞硝胺雜質(zhì)的可能途徑（EMA發(fā)現(xiàn)采用含有硝化纖維的泡罩包裝與含胺的印刷油墨可產(chǎn)生亞硝胺雜質(zhì)，當(dāng)泡罩熱封時(shí)汽化冷凝轉(zhuǎn)移至制劑表面）。另外評(píng)估過(guò)程需要關(guān)注是否產(chǎn)生與藥物成分相關(guān)的亞硝胺雜質(zhì)，以降低潛在風(fēng)險(xiǎn)。
亞硝胺雜質(zhì)的產(chǎn)生與化合物的合成工藝路線密切相關(guān)，在原料藥合成工藝開(kāi)發(fā)期間，應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)工藝和溶劑試劑分析出現(xiàn)亞硝胺雜質(zhì)的潛在可能，從源頭阻斷產(chǎn)生亞硝胺類雜質(zhì)。對(duì)于同一化合物的合成路徑各生產(chǎn)商并不完全相同，意味著亞硝胺雜質(zhì)的潛在來(lái)源也有多種可能。例如纈沙坦原料藥通常采用疊氮化鈉作為合成四氮唑的關(guān)鍵物料，部分生產(chǎn)工藝采用二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）或在酸性條件下加入亞硝酸鈉或次氯酸鈉作為疊氮化鈉的淬滅劑，由于DMF可能存在并降解產(chǎn)生二甲胺，疊氮化鈉可能引入亞硝酸鈉而存在產(chǎn)生亞硝胺雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)?！度擞盟幬镏械膩喯醢冯s質(zhì)評(píng)估報(bào)告》指出極性非質(zhì)子傳遞溶劑[例如DMF、二甲基乙酰胺（DMAC）和 N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）]有形成亞硝胺雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)，建議盡可能避免使用，如無(wú)法避免應(yīng)實(shí)施減少亞硝胺雜質(zhì)產(chǎn)生的控制策略[3]。對(duì)于無(wú)法替換的試劑和溶劑，需要優(yōu)化工藝并增加適宜的雜質(zhì)清除步驟，制定合理的過(guò)程控制，保證生產(chǎn)過(guò)程可有效去除此類雜質(zhì)。
基于亞硝胺雜質(zhì)的高致癌風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)于沙坦類、二甲雙胍等藥物應(yīng)提供全面的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估報(bào)告，例如申報(bào)原料藥應(yīng)提供詳盡的生產(chǎn)工藝描述，加強(qiáng)相關(guān)物料和溶劑的質(zhì)量控制及生產(chǎn)工藝的過(guò)程控制，并制定合理的控制策略。另外對(duì)于目前未檢出亞硝胺雜質(zhì)的藥物可結(jié)合亞硝胺雜質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)理開(kāi)展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
3.2 分析方法及控制限度
亞硝胺雜質(zhì)在人體中的可接受限度較低，因此分析方法的高靈敏度是亞硝胺雜質(zhì)準(zhǔn)確定量的關(guān)鍵?！度擞盟幬镏衼喯醢冯s質(zhì)的控制》指南規(guī)定亞硝胺雜質(zhì)的檢測(cè)需要使用LOQ為十億分之一（Part Per Billion，ppb）級(jí)別的方法，對(duì)于每日最大給藥劑量高于1克的藥品以及采用一種方法檢測(cè)多個(gè)亞硝胺雜質(zhì)時(shí)，均應(yīng)建立LOQ更低的分析方法（原料藥和制劑分析方法的LOQ≤0.03 ppm）[4]。
目前，USP及EP已收載的亞硝胺檢測(cè)方法均采用液相/氣相與質(zhì)譜聯(lián)用的方法，以提高檢測(cè)方法的靈敏度?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》暫未收載亞硝胺雜質(zhì)的檢測(cè)方法，結(jié)合《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》規(guī)定可以參考權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)布的方法，亦可自行開(kāi)發(fā)方法。審評(píng)中發(fā)現(xiàn)部分申請(qǐng)人采用自擬方法用于亞硝胺雜質(zhì)的檢測(cè)，也通常使用此分析方法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)亞硝胺雜質(zhì)，對(duì)于上述情形需要進(jìn)一步說(shuō)明擬定分析方法的優(yōu)勢(shì)并提供方法建立的依據(jù)及優(yōu)化過(guò)程，并且確認(rèn)方法學(xué)驗(yàn)證及定量限符合要求。此外，樣品的制備方法也是影響亞硝胺痕量雜質(zhì)分析的關(guān)鍵因素，樣品的制備過(guò)程、選取適宜的溶解試劑或提取步驟等均需要開(kāi)展合理的支持性研究，以避免供試品溶液的配制過(guò)程造成雜質(zhì)提取不完全或產(chǎn)生新的亞硝胺雜質(zhì)，干擾檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
如藥品中檢出2個(gè)或以上亞硝胺雜質(zhì)，其雜質(zhì)限度總量的控制目前暫時(shí)可借鑒USP/EP關(guān)于多個(gè)亞硝胺雜質(zhì)的規(guī)定，合理擬定控制限度，并就亞硝胺雜質(zhì)限度的控制及時(shí)與國(guó)家藥品審評(píng)中心進(jìn)行溝通交流。
4、 結(jié)語(yǔ)
目前，亞硝胺雜質(zhì)產(chǎn)生的主要來(lái)源及機(jī)理已逐漸明晰，但隨著研究探索的深入和新的亞硝胺雜質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，對(duì)亞硝胺雜質(zhì)的監(jiān)管和控制仍面臨挑戰(zhàn)。藥品上市許可持有人/藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)切實(shí)履行藥品質(zhì)量管理的責(zé)任，對(duì)藥品的安全和質(zhì)量進(jìn)行全生命周期管理，高度重視藥品中亞硝胺雜質(zhì)控制的重要性。無(wú)論關(guān)于在研產(chǎn)品還是獲準(zhǔn)上市品種，申請(qǐng)人均需持續(xù)關(guān)注國(guó)內(nèi)外藥品監(jiān)管部門對(duì)化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)的監(jiān)管要求，及時(shí)對(duì)新發(fā)現(xiàn)的雜質(zhì)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，根據(jù)研究結(jié)果采取相應(yīng)的措施，并制定合理的控制策略，以推進(jìn)我國(guó)亞硝胺雜質(zhì)的科學(xué)監(jiān)管，保障藥品質(zhì)量可控，滿足臨床用藥需求。
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