不溶性微粒指不溶于水和有機(jī)溶劑，非代謝性的，肉眼所看不見(jiàn)的顆粒物。不溶性微粒粒徑一般小于50μm的微粒，可見(jiàn)異物指在特定條件下目視即可觀測(cè)到的不溶性物質(zhì)，其粒徑或長(zhǎng)度通常大于50μm?？梢?jiàn)異物/不溶性微粒的控制是保證注射劑安全使用的一項(xiàng)重要指標(biāo)。對(duì)于生物制品注射劑而言，蛋白質(zhì)產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)有聚集并形成不溶性微粒的傾向，且這種聚集會(huì)影響藥效，增加潛在的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。因此，不溶性微粒/可見(jiàn)異物是生物注射劑的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一。本文對(duì)生物制劑中不溶性微粒/可見(jiàn)異物產(chǎn)生原因、檢測(cè)方法和控制策略進(jìn)行分析，以期為生物注射劑研發(fā)提供參考。
1. 產(chǎn)生原因
1.1外源污染
如原輔包中未清除的金屬屑、玻璃屑、纖毛、塊狀物等，設(shè)備清潔不當(dāng)，人員、環(huán)境中帶來(lái)的一些顆粒等。
1.2制劑降解
制劑儲(chǔ)存期間產(chǎn)生不溶性微粒/可見(jiàn)異物，例如，氧化、水解，高溫引起活性藥物成分與輔料相互作用，藥物包材相互作用產(chǎn)生的可浸出物，包材中硅油的脫落等。
1.3界面應(yīng)力
界面應(yīng)力可以發(fā)生在所有界面，例如，在含有硅油作為潤(rùn)滑劑的樣品的液-液界面，如預(yù)填充注射器，蛋白質(zhì)可以聚集在油滴表面。在溶液和頂空交界面的靜脈液袋中，蛋白質(zhì)在液-氣界面上聚集，儲(chǔ)存或樣品凍融時(shí)在固液界面聚集等。
1.4聚山梨酸酯降解
處方中通常添加表面活性劑以保護(hù)蛋白質(zhì)免受界面應(yīng)力的影響。最常用的表面活性劑包括聚山梨酸酯20和聚山梨酸酯80以及波洛沙姆188。聚山梨酯是一種非離子表面活性劑，由于多種不同的脂肪酸作為側(cè)鏈存在，聚山梨酯的組成是高度不均勻的。已知聚山梨酸酯可以通過(guò)水解和/或氧化降解，產(chǎn)生不同的不溶性降解產(chǎn)物，導(dǎo)致不溶性微粒/可見(jiàn)異物產(chǎn)生。此外，酶水解被認(rèn)為是在抗體藥物中聚山梨酯降解導(dǎo)致蛋白聚體微粒形成的根本原因。一些脂肪酶、酯酶、宿主細(xì)胞蛋白殘留磷脂酶 B2 都可以在酯鍵處裂解聚山梨酯，從而形成游離脂肪酸，由于游離脂肪酸在水溶液中溶解度差，當(dāng)?shù)蜏乇４鏁r(shí)，制劑中形成不溶性微粒/可見(jiàn)異物，對(duì)其蛋白質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性產(chǎn)生一定影響，從而影響藥品的有效期。
2. 檢測(cè)方法：
2.1不溶性微粒檢查法
《中國(guó)藥典》2020 年版三部采用光阻法和顯微計(jì)數(shù)法。USP<1787>建議使用4-100μm粒徑范圍內(nèi)的形態(tài)測(cè)量，這可能有助于區(qū)分粒子來(lái)源為固有的、內(nèi)在的/外在的，以降低不溶性微粒帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。但由于其檢測(cè)原理，無(wú)法區(qū)分不同類型的顆粒，例如蛋白質(zhì)聚集體、硅油液滴等。此外可能無(wú)法檢測(cè)到半透明的蛋白質(zhì)聚集體，從而低估了樣品中的總顆粒。近年來(lái)流行的流式成像顯微鏡(FIM)技術(shù)通過(guò)使用直接對(duì)顆粒進(jìn)行成像的FIM不僅可以獲得形態(tài)信息還能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)聚集體與其他顆粒（如硅油滴、氣泡和其他外在和內(nèi)在的顆粒雜質(zhì)）區(qū)分開(kāi)來(lái)。
2.2 可見(jiàn)異物檢查法
《中國(guó)藥典》2020 年版三部采用燈檢法和光散射法。然而，除了大小之外，可見(jiàn)性的限制還取決于許多因素包括顏色、形狀、透明度、反射率以及檢測(cè)人員的培訓(xùn)。要想了解粒子具體類型通常需要將他們分離后進(jìn)行表征。任何一種分離方法都應(yīng)注意需要去除干擾(例如，用水沖洗樣品的可溶性賦形劑)。物理方法包括顯微表征和成像方法?；瘜W(xué)鑒定通常涉及光譜技術(shù)，如傅里葉變換紅外(FTIR)和拉曼光譜，它們適用于識(shí)別有機(jī)材料，如彈性體，纖維和產(chǎn)品相關(guān)顆粒(蛋白質(zhì)，輔料)。這些都有助于確定顆粒來(lái)源、引入途徑。
3. 控制策略
3.1 早期開(kāi)發(fā)階段
充分了解藥物的相關(guān)性質(zhì)，評(píng)估可能產(chǎn)生的顆粒類型。如表面活性劑聚山梨酸酯20和聚山梨酸酯80降解產(chǎn)生顆粒，可以選擇純度較高的聚山梨酸酯，盡量減少降解脂肪酸的產(chǎn)生。包材方面，硅油的存在可能會(huì)促進(jìn)顆粒產(chǎn)生，應(yīng)充分評(píng)估考察硅油的用量對(duì)產(chǎn)品的影響。必要時(shí)可以選擇無(wú)硅油的產(chǎn)品。工藝優(yōu)化，選擇合適的凍干工藝，盡量避免冷凍應(yīng)力導(dǎo)致的蛋白聚集。
有些情況下，顆粒的產(chǎn)生是不可避免的，一些上市生物制品中就申稱含有一些顆粒。如Bristol-Myers Squibb公司生產(chǎn)的Erbitux®可能含有少量易見(jiàn)、白色、無(wú)定形的西妥昔單抗顆粒。Amgen公司生產(chǎn)的Vectibix®可能含有可見(jiàn)的半透明到白色，無(wú)定形的蛋白質(zhì)顆粒。
這種情況下就需要對(duì)粒子進(jìn)行鑒別，評(píng)估產(chǎn)生的數(shù)量和尺寸，并進(jìn)行毒理學(xué)和安全性評(píng)估，以確定不會(huì)對(duì)患者產(chǎn)生安全性的影響。
3.2 生產(chǎn)過(guò)程中控制
應(yīng)關(guān)注產(chǎn)品生產(chǎn)線上可能帶來(lái)的異物，如對(duì)包材清洗進(jìn)行驗(yàn)證，環(huán)境監(jiān)測(cè)，人員培訓(xùn)。評(píng)估藥液在生產(chǎn)轉(zhuǎn)移過(guò)程中界面應(yīng)力的影響，如對(duì)攪拌速度、灌裝速度進(jìn)行合理的控制。檢測(cè)灌裝或裝配線中的故障，如玻璃破裂或漏油。在生產(chǎn)后，每批產(chǎn)品都要進(jìn)行100%密封性檢驗(yàn)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)外觀缺陷，剔除不合格產(chǎn)品。
3.3 穩(wěn)定性研究
大多數(shù)固有的粒子現(xiàn)象產(chǎn)生于穩(wěn)定性階段，可以通過(guò)影響因素加速試驗(yàn)及早發(fā)現(xiàn)粒子的產(chǎn)生情況。在整個(gè)穩(wěn)定性研究期間按照藥典要求進(jìn)行可見(jiàn)異物和不溶性微粒的監(jiān)控，并進(jìn)行趨勢(shì)分析。對(duì)超出藥典標(biāo)準(zhǔn)要求的顆粒進(jìn)行表征，確定顆粒來(lái)源和控制措施。依據(jù)穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)確定產(chǎn)品儲(chǔ)存的條件和包材的相容性，為產(chǎn)品有效期制定提供依據(jù)。關(guān)注使用中穩(wěn)定性，特別是需要進(jìn)一步稀釋的產(chǎn)品，由于表面活性劑濃度的降低和一些操作產(chǎn)生的界面應(yīng)力會(huì)導(dǎo)致使用過(guò)程中顆粒的產(chǎn)生。凍融應(yīng)力也可能會(huì)導(dǎo)致顆粒的增加。模擬運(yùn)輸試驗(yàn)，評(píng)估運(yùn)輸過(guò)程對(duì)顆粒的影響。
3.4 上市后監(jiān)控
產(chǎn)品上市持續(xù)監(jiān)控對(duì)于確定開(kāi)發(fā)階段制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)非常重要。任何在生產(chǎn)過(guò)程中引入的變化(例如，配方變化、包材的變更等)應(yīng)徹底評(píng)估其對(duì)顆粒形成的影響。此外，在研發(fā)階段發(fā)現(xiàn)顆粒的情況下，上市后批次應(yīng)密切觀察，以檢測(cè)與研發(fā)批次之間的差異。同時(shí)，通過(guò)上市后大批量的使用人群，進(jìn)一步評(píng)估產(chǎn)品的安全性。
總結(jié)：
綜上所述，生物注射劑在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)階段就應(yīng)充分評(píng)估可能產(chǎn)生不溶性微粒/可見(jiàn)異物的因素。生產(chǎn)過(guò)程中盡量避免外來(lái)異物的污染。通過(guò)穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)存期間和使用過(guò)程中可能產(chǎn)生的不溶性微粒/可見(jiàn)異物。上市后持續(xù)監(jiān)測(cè)，及早發(fā)現(xiàn)上市產(chǎn)品與研發(fā)產(chǎn)品的差異。一旦發(fā)現(xiàn)了超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的不溶性微粒/可見(jiàn)異物需要進(jìn)一步檢測(cè)分析顆粒類型及來(lái)源，制定合理的控制策略。對(duì)于無(wú)法避免的產(chǎn)品固有不溶性微粒/可見(jiàn)異物需要進(jìn)行毒理評(píng)估產(chǎn)品安全性，并在臨床中持續(xù)觀察產(chǎn)品對(duì)人體安全性的影響。
近年來(lái)，各種新型生物藥的開(kāi)發(fā)火熱，如LNP，細(xì)胞治療藥物等本身就具有顆粒的性質(zhì)，如何區(qū)分藥物顆粒、蛋白聚集、外來(lái)異物給不溶性微粒/可見(jiàn)異物檢測(cè)帶來(lái)了挑戰(zhàn)。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，AI智能算法等先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)可以更好的對(duì)不溶性的來(lái)源進(jìn)行分類和整理，為快速鑒別顆粒，加快生物產(chǎn)品的研發(fā)提供了助力。
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