1. 背景介紹
在藥物有關(guān)物質(zhì)分析過程中，計(jì)算結(jié)果時(shí)會(huì)經(jīng)常遇到使用校正因子（Correction Factor , CF）或者相對(duì)響應(yīng)值因子（Relative Response Factor, RRF）的情況，但有些分析員對(duì)CF和RRF的來源和應(yīng)用還存有疑惑，本文將對(duì)CF和RRF的來源和應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的闡述，本文僅代表個(gè)人觀點(diǎn)，如有不足之處，還請(qǐng)各位同仁指正。
2. CF和RRF的來源
高效液相色譜法定量的原則是在一定濃度范圍內(nèi)，物質(zhì)的濃度或量與物質(zhì)響應(yīng)值呈一定的相關(guān)性。以物質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，物質(zhì)響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見線性圖圖1和線性數(shù)據(jù)表1。
表1 線性數(shù)據(jù)
圖1 線性圖
從表1中，可以得出結(jié)論物質(zhì)響應(yīng)值/物質(zhì)濃度可以近似為一個(gè)恒定的值，從圖1中可以得出以該物質(zhì)與物質(zhì)響應(yīng)值繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為1.0000，因此該物質(zhì)濃度在1-8μg/ml范圍內(nèi)，與物質(zhì)響應(yīng)值呈線性相關(guān)。根據(jù)上述的結(jié)論可以推導(dǎo)出，如果我們有該物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品，即含量已知，那么在濃度1-8μg/ml范圍內(nèi)，就可以按照下面公式計(jì)算待測(cè)物質(zhì)的樣品含量：
Astd表示該物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值；Cstd 表示該物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度；Aspl 表示待測(cè)物質(zhì)的響應(yīng)值；獲得以上3個(gè)數(shù)值后，我們就可以計(jì)算Cspl，即待測(cè)物質(zhì)的濃度。該計(jì)算方法，在測(cè)定一種物質(zhì)的含量時(shí)需要使用同一物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品，被稱作為外標(biāo)法定量方式。在有關(guān)物質(zhì)中，也會(huì)采用外標(biāo)法定量。但由于有關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的可及性以及經(jīng)濟(jì)性問題，有關(guān)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品獲取具有一定的局限性。這時(shí)便引入了校正因子和相對(duì)響應(yīng)值因子。
從圖1和表1中可以知道一種相同物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)，物質(zhì)的濃度或量與物質(zhì)響應(yīng)值呈一定的相關(guān)性。但因?yàn)椴煌镔|(zhì)之間結(jié)構(gòu)存在差異，所以在HPLC分析中，即使不同物質(zhì)的量相同，響應(yīng)值也存在一定的差異。但這種差異也存在一定的相關(guān)性，即CF和RRF。以主成分和雜質(zhì)的線性數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2和圖2。主成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=10010.7073x-70.1707，雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=15102.9329x-186.5183，在檢驗(yàn)操作誤差和儀器誤差可控且較小的情況下，截距可以忽略，所以兩個(gè)方程可以，近似為y=10010.7073x和y=15102.9329x，方程中的斜率即響應(yīng)值/濃度和表2中的結(jié)果進(jìn)本一致。所以在濃度相同的情況下可以得出：
將該公式引入有關(guān)物質(zhì)計(jì)算公式中即可進(jìn)行相關(guān)雜質(zhì)的計(jì)算，校正因子為主成分斜率/雜質(zhì)斜率，計(jì)算時(shí)需要放在計(jì)算公式的分子部分，將雜質(zhì)峰面積折算為主成分峰面積。而相對(duì)響應(yīng)值因子為雜質(zhì)斜率/主成分斜率，計(jì)算時(shí)需要放在計(jì)算公式的分母部分，將主成分的峰面積折算為雜質(zhì)峰面積。
表2 主成分和雜質(zhì)線性數(shù)據(jù)表
圖2 主成分和雜質(zhì)線性圖
校正因子和相對(duì)響應(yīng)值因子互為倒數(shù)，歐洲藥典和中國(guó)藥典中通常使用校正因子，美國(guó)藥典通常使用相對(duì)響應(yīng)值因子。其歐洲藥典和中國(guó)藥典通常采用帶校正因子的主成分自身對(duì)照法，即對(duì)照溶液由供試品溶液稀釋制得，定量時(shí)需要每份供試品溶液稀釋制得自身對(duì)照溶液，而美國(guó)藥典采用的是帶相對(duì)響應(yīng)值因子的主成分外標(biāo)法，即對(duì)照溶液由標(biāo)準(zhǔn)品制備而得，在計(jì)算過程中需要對(duì)質(zhì)量進(jìn)行折算，詳見表3內(nèi)容。
表3帶校正因子主成分自身對(duì)照法和帶相對(duì)響應(yīng)值因子主成分外標(biāo)法比較表
3. CF和RRF的應(yīng)用注意事項(xiàng)
CF和RRF的測(cè)定，應(yīng)當(dāng)覆蓋方法的應(yīng)用范圍，一般從定量限（LOQ）水平開始，至限度水平的120%，建議可以將上限提高一些，使方法應(yīng)用時(shí)可以更加靈活。CF和RRF為0.9-1.1之間時(shí)，可不再進(jìn)行校正，此為藥典要求，但在實(shí)際操作過程中建議采用實(shí)際值進(jìn)行折算，避免出現(xiàn)所得結(jié)果在限度邊緣出現(xiàn)超標(biāo)的尷尬情況。藥典中給定的CF和RRF通常為一位小數(shù)，對(duì)定量結(jié)果影響較大，因此建議采用保留兩位小數(shù)進(jìn)行校正。如果超過0.2-5.0范圍時(shí)，說明兩種物質(zhì)響應(yīng)值差異較大，此時(shí)定量的誤差較大，建議采用雜質(zhì)外標(biāo)法進(jìn)行定量。
除雜質(zhì)外標(biāo)法外，還有一種另外方式和大家分享下，某一項(xiàng)目有關(guān)物質(zhì)為雙波長(zhǎng)方法，主成分和雜質(zhì)A以及未知雜質(zhì)均在波長(zhǎng)A下測(cè)定，但雜質(zhì)B在波長(zhǎng)A下響應(yīng)值較低，所以在波長(zhǎng)B下測(cè)定并采用波長(zhǎng)B下的主成分進(jìn)行定量，方法源于USP，但在波長(zhǎng)B下RRF值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于5.0，雖然是USP方法，但也是審評(píng)老師質(zhì)疑了定量的準(zhǔn)確性問題。后參考BP方法，在波長(zhǎng)B在測(cè)試雜質(zhì)B，使用波長(zhǎng)A下的主成分，計(jì)算雜質(zhì)B的含量，這樣RRF既可落在0.2-5.0之間，并被審評(píng)老師所接受，見圖3。
圖3 雜質(zhì)B定量方式的修訂
在CF和RRF計(jì)算過程中，應(yīng)當(dāng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的純度和鹽基進(jìn)行折算，以保證所得因子的準(zhǔn)確性，此處非常非常關(guān)鍵，經(jīng)常容易被忽略，望引起各位的重視。此外，各國(guó)藥典方法中有時(shí)也會(huì)給定CF和RRF，測(cè)定時(shí)應(yīng)與藥典給定值進(jìn)行比對(duì)，如果差異過大，因進(jìn)行分析，是否雜質(zhì)對(duì)照品不穩(wěn)定或吸潮等，筆者在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中確確實(shí)實(shí)遇到了類似的問題，如果雜質(zhì)對(duì)照品不穩(wěn)定或吸潮，應(yīng)盡可能壓縮采購(gòu)周期，并限定好運(yùn)輸條件，到貨后立即測(cè)定。CF和RRF通常只針對(duì)已知雜質(zhì)，對(duì)于未知雜質(zhì)，則不再進(jìn)行校正。
4. 結(jié)論
鑒于當(dāng)前審評(píng)尺度，有關(guān)物質(zhì)方法中控制的雜質(zhì)個(gè)數(shù)非常多，所以CF和RRF的應(yīng)用越來越為廣泛，CF和RRF會(huì)直接參與到雜質(zhì)的結(jié)果計(jì)算，所以非常重要，為保證檢測(cè)結(jié)果的有效性和準(zhǔn)確性，對(duì)CF和RRF的研究一定小心并且要透徹，建議在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部盡可能的考慮多因素進(jìn)行測(cè)定，如不同儀器，不同人員，以便項(xiàng)目可以順利申報(bào)注冊(cè)，如果前期的研究工作不夠徹底，從方法開發(fā)，驗(yàn)證，放行檢測(cè)再到穩(wěn)定性數(shù)據(jù)都會(huì)可能受到影響。。最后，希望本文對(duì)您有所幫助！
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