分子熒光光度法在藥物分析中具有很高的應(yīng)用價值。它能夠?qū)崿F(xiàn)對微量物質(zhì)的檢測和定量分析，具有很高的選擇性和靈敏度，在藥物分析中應(yīng)用廣泛。
一、分子熒光產(chǎn)生的機理
1.1 分子的激發(fā)態(tài)
當(dāng)分子吸收輻射能量后，價電子從基態(tài)躍遷到一個更高的能級，分子的這種狀態(tài)稱為激發(fā)態(tài)。
由于電子躍遷過程中可能發(fā)生自旋方向的變化，以M表示電子激發(fā)態(tài)的多重度。
M=2s+1
其中s為電子自旋量子態(tài)。
根據(jù)Puali不相容原理，分子軌道中成對的電子都是自旋方向相反的，兩個電子自旋量子數(shù)m分別為+1/2和-1/2，如果激發(fā)后兩個電子自旋方向不變，此時電子激發(fā)態(tài)多重度為：
M=2*[(+1/2)+(-1/2)]+1=1
稱這種狀態(tài)為激發(fā)單重態(tài)，用S表示。
如果分子軌道中電子對被激發(fā)后產(chǎn)生了自旋方向的改變，此時兩個電子的自旋量子數(shù)分別為+1/2和+1/2，此時電子激發(fā)態(tài)多重度為;
M=2*[(+1/2)+(+1/2)]+1=3
稱這種狀態(tài)為激發(fā)三重態(tài)，用T表示。
1.2激發(fā)態(tài)分子的衰變方式
激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，較短時間內(nèi)，電子就會躍遷至基態(tài)，釋放出與吸收時相同數(shù)量的能量。電子躍遷時，如果以釋放光子的形式放出能量，稱為輻射躍遷；如果以振動或熱能方式放出能量，稱為非輻射躍遷。
輻射躍遷過程分子產(chǎn)生熒光和磷光；非輻射躍遷包括振動弛豫(VR)，內(nèi)轉(zhuǎn)化(ic)，系間竄越(isc)。
振動弛豫(VR)是指分子在受到外界激發(fā)后，振動能量逐漸轉(zhuǎn)化為其他形式的能量，最終使分子回到當(dāng)前電子能級最低振動能級的過程。分子的振動能量會逐漸轉(zhuǎn)化為分子的轉(zhuǎn)動能量，也可能通過分子與周圍環(huán)境的相互作用而轉(zhuǎn)化為熱能。
內(nèi)轉(zhuǎn)化(ic)是指分子在激發(fā)態(tài)下，通過非輻射的方式將能量轉(zhuǎn)化為分子內(nèi)部振動、轉(zhuǎn)動或電子結(jié)構(gòu)的改變的過程。在這種過程中，分子從相同多重態(tài)的一個電子能級衰變到另外一個電子能級，但并不通過輻射光子釋放能量。
系間竄越(isc)是指分子在激發(fā)態(tài)下，通過非輻射的方式將能量從一個電子多重態(tài)到另一個電子多重態(tài)的過程。同樣的，不通過輻射光子釋放能量
1.3熒光和磷光的產(chǎn)生
圖1為Jablonski能級圖，假如分子被激發(fā)到S2電子激發(fā)單重態(tài)，在較短時間內(nèi)，會通過振動弛豫回到該電子能級的最低振動能級，然后通過內(nèi)轉(zhuǎn)化的形式，最終回到第一激發(fā)單重態(tài)，然后通過振動弛豫衰變到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。
此時如果電子躍遷到基態(tài)，并以輻射形式放出能量，稱為熒光(F)。
此時如果電子通過系間竄越躍遷到三重態(tài)，經(jīng)振動弛豫，衰變到該能級最低振動能級后，以輻射形式放出能量，稱為磷光(P)。
由于激發(fā)單重態(tài)間內(nèi)轉(zhuǎn)化速率很快，并且S2及以上的激發(fā)態(tài)壽命很短，很快衰變至第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級，所以觀察到的熒光通常是電子由第一激發(fā)單重態(tài)最低振動能級躍遷至基態(tài)而產(chǎn)生的，且持續(xù)時間短。
由于系間竄越是自旋禁阻的，因此其速率較慢。同時由于第一激發(fā)三重態(tài)能量低于第一激發(fā)單重態(tài)，分子較為穩(wěn)定，所以分子磷光常常能持續(xù)一段時間。
圖1 Jablonski能級圖
二、分子熒光光度法在藥物分析中的應(yīng)用
分子熒光光度法在藥物分析中有下列應(yīng)用：
(1)生物樣品中的藥物含量定量分析。例如通過分子熒光光度法可以直接從血液、尿液等生物樣品中定量測定某些抗生素、抗病毒藥等藥物的含量。
(2)復(fù)方制劑中的單一成分含量定量。例如可以從復(fù)方膠囊、片劑等復(fù)方制劑中，選擇性地定量某一有效成分。
(3)原料藥和制劑中的質(zhì)量控制。例如可以用于原料藥和成品藥中的有效成分含量檢驗，以確保質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)。
(4)藥物濃度動態(tài)監(jiān)測。例如可以實時監(jiān)測體外試驗中的藥物濃度變化曲線，為藥代動力學(xué)研究提供參考。
分子熒光光度法適用于測定含有共軛體系的脂肪族有機化合物，如維生素A等；以及含有共軛體系的芳香族有機化合物及衍生物，如苯并(a)芘，黃曲霉毒素G等。
三、影響分子熒光的因素
3.1 溶液中雜質(zhì)的影響
在溶液中，雜質(zhì)會對分子熒光產(chǎn)生影響。這種影響通常被稱為顆粒對分子熒光的猝滅作用，主要有兩種類型：
靜態(tài)猝滅：顆粒（如固體顆?；虼蠓肿樱┑拇嬖跁?dǎo)致分子熒光的靜態(tài)猝滅，這是因為顆粒的吸收和散射作用會減少分子激發(fā)態(tài)的壽命，從而降低分子發(fā)生熒光的可能性。顆粒越多，靜態(tài)猝滅效應(yīng)就越顯著。
動態(tài)猝滅：顆粒的運動也可能對分子的熒光產(chǎn)生影響。顆粒的運動會導(dǎo)致分子的激發(fā)態(tài)能量被傳遞給顆粒，從而減少分子熒光的發(fā)射。這種效應(yīng)通常在顆粒與分子之間存在較大的運動相互作用時發(fā)生。
在實際應(yīng)用中，顆粒對分子熒光的影響可能會對定性和定量分析產(chǎn)生干擾。因此，在進行實驗時，需要考慮溶液中顆粒的存在，并采取相應(yīng)的措施來減少或糾正這種影響，例如采用高純度溶劑，對溶劑進行過濾，對溶液進行離心等。
3.2 pH對分子熒光的影響
許多分子熒光發(fā)射強度會隨著溶液pH的變化而改變。這是因為pH的變化會影響分子的電荷狀態(tài)，從而影響電子由激發(fā)態(tài)到基態(tài)之間的躍遷，進而影響熒光發(fā)射的強度。
溶液的pH也可能會影響分子熒光的發(fā)射波長。一些蛋白質(zhì)在不同pH條件下會表現(xiàn)出不同的發(fā)射波長。
部分化合物的熒光在不同pH條件下的穩(wěn)定性也不同，有些在酸性條件下會發(fā)生猝滅，而在堿性條件下熒光則更加穩(wěn)定。
3.3氧分子的影響
氧分子的猝滅作用：氧分子可以與分子的激發(fā)態(tài)發(fā)生碰撞，從而使其由激發(fā)態(tài)衰變至基態(tài)，這種現(xiàn)象被稱為氧分子的猝滅作用。氧分子的猝滅作用會導(dǎo)致分子熒光的強度降低，從而影響熒光測量的準(zhǔn)確性。因此，在進行熒光實驗時，需要避免或減少氧分子的存在，例如在實驗過程中使用氮氣或氬氣氣氛。
氧分子的光敏作用：氧分子的存在可能會導(dǎo)致光敏反應(yīng)的發(fā)生，從而影響分子的熒光性質(zhì)。例如，氧分子可以與一些熒光染料發(fā)生光氧化反應(yīng)，導(dǎo)致其熒光發(fā)射強度的降低或發(fā)射波長的變化。
3.4溫度的影響
溫度可以對分子熒光產(chǎn)生影響，主要有以下幾個方面：
分子的激發(fā)態(tài)壽命：溫度的升高會增加分子的振動和旋轉(zhuǎn)，從而縮短分子的激發(fā)態(tài)壽命。這會導(dǎo)致熒光發(fā)射強度的降低或發(fā)射波長的變化。
分子的熒光發(fā)射強度：溫度的升高會增加分子的熱運動，從而增加分子與周圍分子的碰撞，導(dǎo)致熒光發(fā)射強度的降低。
分子熒光的穩(wěn)定性：一些物質(zhì)分子會在高溫下可能會發(fā)生猝滅，導(dǎo)致熒光發(fā)射強度的降低。
因此，在進行熒光實驗時，需要控制溫度的變化，進行必要的校正和控制。例如，可以使用恒溫器或冷卻器來控制溫度。
3.5表面活性劑致熒光猝滅
對于很多化合物，要避免表面活性劑的使用，特別是與目標(biāo)物質(zhì)帶有相反電荷的表面活性劑。鹽酸肼屈嗪是一種治療高血壓的藥物，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2所示，帶正電，因其具有共軛體系，故具有熒光性質(zhì)，但當(dāng)其與陰離子表面活性劑，如脂肪酸鹽混合時會產(chǎn)生熒光猝滅效應(yīng)。
圖2 鹽酸肼屈嗪
另外在進行分子熒光測定的過程中，應(yīng)注意有些物質(zhì)弛豫時間較長，此時可采用具有近似激發(fā)和發(fā)射波長的物質(zhì)作為參比溶液，使得定量更為準(zhǔn)確。
目前為止，熒光光度法在藥學(xué)中應(yīng)用較為廣泛，將熒光光度法與液相色譜聯(lián)用，可以用于物質(zhì)的定性定量分析。
參考文獻(xiàn)
中華人民共和國藥典(2020版)
中國藥典分析檢測技術(shù)指南
分析化學(xué)(第五版) 武漢大學(xué)主編
京公網(wǎng)安備11010802046783號
