液相色譜法為測試原料藥、中間體、制劑和包材中各成分含量及雜質(zhì)的主要方法，但許多物質(zhì)并沒有標準方法可依據(jù)，此時免不了需要開發(fā)新的方法。而液相方法開發(fā)中，色譜柱作為液相色譜法的核心，如何選擇合適的色譜柱就顯得至關(guān)重要。本文筆者將從總體思路、考慮因素和應用范圍三方面闡述如何選擇液相色譜柱。
一、 液相色譜柱選擇的總體思路
1.評估待測物的理化性質(zhì)：如化學結(jié)構(gòu)、溶解性、穩(wěn)定性（如是否易被氧化/被還原/水解）、酸堿性等，尤其化學結(jié)構(gòu)是決定性質(zhì)的關(guān)鍵因素，如共軛基團有強紫外吸收和強熒光性；
2.確定分析目的：是否要求高分離度、高柱效、短分析時間、高靈敏度、耐高壓、長柱壽命，低成本等；
3.選擇合適的色譜柱：了解色譜填料的成分、物理和化學性質(zhì)，如填料的粒徑、孔徑、耐受溫度、耐受pH、對待測物質(zhì)的吸附性等。
二、 液相色譜柱選擇的考慮因素
本章節(jié)內(nèi)容將從色譜柱本身的理化性質(zhì)論述色譜柱選擇時需考慮的因素。
2.1 填料基質(zhì)
2.1.1 硅膠基質(zhì)
大多數(shù)應用的液相色譜柱填料基質(zhì)為硅膠，此類填料純度高、成本低、機械強度大，易于修飾基團（如苯基鍵合、氨基鍵合、氰基鍵合等），但耐受的pH值和溫度范圍有限：大多硅膠基質(zhì)填料的pH適用范圍為 2～8，但經(jīng)過特殊修飾的硅膠鍵合相pH適用范圍可寬至1.5～10，還有經(jīng)過特殊修飾的硅膠鍵合相在低pH下穩(wěn)定，如安捷倫ZORBAX RRHD stablebond-C18的pH在1～8穩(wěn)定；硅膠基質(zhì)的耐受溫度上限通常是60 ℃，有的色譜柱在高pH下的耐受溫度為40 ℃。
2.1.2 聚合物基質(zhì)
聚合物填料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂，其優(yōu)點是耐受的pH值范圍寬——在1～14均可使用，另外更耐高溫（可以達到80 ℃以上）。相對于硅膠基質(zhì)的C18填料，這類填料具有較強的疏水性，而且大孔的聚合物對蛋白質(zhì)等樣品的分離非常有效。其缺點是相對硅膠基質(zhì)填料，色譜柱柱效較低，機械強度小。
2.2 顆粒外形
大多現(xiàn)代HPLC填料都是球形顆粒，但有時是不規(guī)則的顆粒。球形顆?？商峁┹^低的柱壓、較高的柱效、穩(wěn)定性以及較長的壽命；在使用高粘度的流動相（如磷酸）或樣品溶液較粘稠時，不規(guī)則顆粒有較大的比表面積，更有利于兩相的充分作用，且價格相對低廉。
2.3 顆粒粒徑
粒徑越小，柱效越高、分離度越高，但耐高壓性越差。最常用的是5 μm粒徑的色譜柱；若對分離度要求較高，可選擇1.5～3 μm的填料，有利于解決一些基質(zhì)復雜、多組分樣品的分離問題，UPLC可以使用1.5 μm的填料；10 μm或更大粒徑的填料常用于半制備或制備柱。
2.4 含碳量
含碳量指的是硅膠表面鍵合相的比例，與比表面積和鍵合相覆蓋率等有關(guān)。高含碳量提供高柱容量、高分辨率，常用于要求高分離度的復雜樣品，但由于兩相相互作用時間較長，導致分析時間較長；低含碳量的色譜柱分析時間較短、可展現(xiàn)不同的選擇性，常用于需要快速分析的簡單樣品及需要高水相條件的樣品。一般C18的含碳量在7 %-19 %不等。
2.5 孔徑和比表面積
HPLC吸附介質(zhì)是多孔的顆粒，大多數(shù)的相互作用于孔內(nèi)進行。因此，分子必須進入孔內(nèi)才能被吸附和分離。
孔徑和比表面積是相輔相成的兩個概念?？讖叫?、比表面積大，反之亦然。比表面積大，可增加樣品分子與鍵合相之間的作用、增強保留、提高載樣量和柱容量及復雜成分的分離度，全多孔型填料就屬于此類填料，對分離度要求高的建議選擇比表面積大的填料；比表面積小，可降低背壓、提高柱效和減少平衡時間，適合梯度分析，核殼型填料就屬于此類填料，在保證分離度的前提下，對分析效率要求高的建議選擇比表面積小的填料。
2.6 孔容和機械強度
孔容，又稱“孔體積”，指單位顆粒的空隙體積大小。它能很好的反映填料的機械強度?？左w積大的填料相對孔體積小的填料機械強度要略弱。孔體積小于等于1.5 mL/g的填料大多用于HPLC分離，而孔體積大于1.5 mL/g的填料主要用于分子排阻色譜和低壓色譜。
2.7 封端率
封端能夠降低化合物與裸露的硅醇基相互作用（如堿性化合物與硅醇基的離子結(jié)合，酸性化合物與硅醇基的范德華力、氫鍵作用）而產(chǎn)生的拖尾峰，從而提高柱效和改善峰形。不封端鍵合相，相對封端鍵合相會產(chǎn)生不同的選擇性，尤其對于極性樣品。
三、 不同液相色譜柱的應用范圍
本章節(jié)將通過一些案例講述不同類型液相色譜柱的應用范圍。
3.1 反相C18色譜柱
C18色譜柱為最常用的反相色譜柱，能滿足大多數(shù)有機物的含量及雜質(zhì)測試，對中等極性、弱極性和非極性物質(zhì)均適用。而選擇何種類型和規(guī)格的C18色譜柱應結(jié)合具體的分離需求而定，如對分離度要求較高的常選用5 μm*4. 6mm*250 mm規(guī)格；分離基質(zhì)復雜和極性接近的物質(zhì)，可選用4 μm*4.6 mm*250 mm規(guī)格或粒徑更小的規(guī)格，如筆者在檢測塞來昔布原料藥的兩種基因毒性雜質(zhì)時采用的就是3 μm*4.6 mm*250 mm規(guī)格的色譜柱，兩種物質(zhì)的分離度可達到2.9，分離度上佳。另外，在保證分離度前提下，若需實現(xiàn)快速分析，往往選擇10 mm或15 mm的短柱，如筆者在用LC-MS/MS法檢測磷酸哌喹原料藥中的一種基因毒性雜質(zhì)時采用的是3 μm*2.1 mm*100 mm的色譜柱，雜質(zhì)與主成分的分離度為2.0，且5 min即可完成一個樣品的檢測。
3.2 反相苯基色譜柱
苯基色譜柱也屬于反相色譜柱中的一種，此類色譜柱對芳香族化合物有較強的選擇性，若普通C18色譜柱測得的芳香族化合物響應較弱可考慮更換苯基色譜柱，如筆者在做塞來昔布原料藥時，用同一廠家、同規(guī)格（均為5 μm*4.6 mm*250 mm）的苯基柱測得的主成分響應約為C18柱的7倍。
3.3 正相色譜柱
正相色譜柱作為反相色譜柱的有效補充，適用于大極性化合物，如反相色譜柱中用超過90 %水相洗脫時出峰仍很快，甚至與溶劑峰接近和重合，此時可考慮更換正相色譜柱。此類色譜柱包括hilic柱、氨基柱、氰基柱等。
3.3.1 hilic柱
hilic柱通常在鍵合烷基鏈中嵌入親水基團以增強對極性物質(zhì)的響應，此類色譜柱適用于糖類物質(zhì)的分析，筆者在做木糖及其衍生物的含量和有關(guān)物質(zhì)時采用的就是此類色譜柱，對一種木糖衍生物的異構(gòu)體也能實現(xiàn)良好分離；
3.3.2 氨基柱和氰基柱
氨基柱和氰基柱是指在鍵合烷基鏈末端分別引入氨基和氰基修飾，以提高對特殊物質(zhì)的選擇性：如氨基柱在糖類、氨基酸、堿、酰胺類物質(zhì)的分離方面是一個很好的選擇；氰基柱由于存在共軛鍵，故在分離氫化和未氫化結(jié)構(gòu)相似物時的選擇性較好。氨基柱和氰基柱往往可以在正相色譜柱和反相色譜柱之間切換使用，但不建議頻繁切換。
3.4 手性色譜柱
手性色譜柱，顧名思義，適用于手性化合物的分離和分析，尤其在藥物領(lǐng)域的異構(gòu)體中應用廣泛。當常規(guī)的反相和正相色譜柱無法實現(xiàn)異構(gòu)體的分離時可考慮采用此類色譜柱。比如，筆者在做1,2-二苯基乙二胺的兩種異構(gòu)體：(1S, 2S)-1, 2-二苯基乙二胺和(1R, 2R)-1, 2-二苯基乙二胺時采用的是5 μm*4.6 mm*250 mm的手性色譜柱，兩者的分離度達到2.0左右。但是手性色譜柱較其他類型色譜柱價格要高，通常在1W+/根，若有此類色譜柱需求的單位還需要做好充足的預算。
3.5 離子交換柱
離子交換柱適用于帶電離子的分離和分析，如離子、蛋白質(zhì)、核酸、部分糖類物質(zhì)等。按照填料類型分為陽離子交換色譜柱、陰離子交換色譜柱、強陽離子交換色譜柱。
陽離子交換色譜柱包括鈣基、氫基柱，主要適用于氨基酸等陽離子物質(zhì)的分析，如筆者在做一種沖洗液中的葡萄糖酸鈣和醋酸鈣的分析時采用的是鈣基柱，兩種物質(zhì)在λ=210nm均有較強的響應，分離度達到3.0；筆者在做葡萄糖有關(guān)物質(zhì)時采用的是氫基柱，幾種主要的有關(guān)物質(zhì)——麥芽糖、麥芽三糖和果糖在示差檢測器下均有較高的靈敏度，檢測限最低可達到0.5 ppm，分離度可達到2.0-2.5。
陰離子交換色譜柱主要適用于有機酸、鹵素離子等陰離子物質(zhì)的分析；強陽離子交換色譜柱具有更高的離子交換容量和選擇性，適用于復雜樣品的分離和分析。
以上僅是結(jié)合筆者自身經(jīng)驗介紹了幾種常見液相色譜柱的類型和應用范圍，實際應用中還有其他特殊類型的色譜柱，如大孔徑色譜柱、小孔徑色譜柱、親和色譜柱、多模式色譜柱、超高效液相色譜柱（UHPLC）、超臨界流體色譜柱（SFC）等，它們在不同領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用，具體選擇何種類型的色譜柱，需要根據(jù)樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)、分離要求和其他目的來進行選擇。
四、 結(jié)論
本文筆者結(jié)合液相色譜柱本身的性質(zhì)特點和自身使用經(jīng)驗，總結(jié)出一套液相色譜柱的選擇方法，希望為廣大同行助力，更希望拋磚引玉，讓優(yōu)秀的老師們分享更多關(guān)于液相色譜柱選擇方面的干貨，大家共同進步！
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