糖尿病的全球發(fā)病人數(shù)高達(dá)4.25億人，其日益加重的疾病負(fù)擔(dān)是一個重大的挑戰(zhàn)，解決該問題對患者、護理人員、醫(yī)療系統(tǒng)和經(jīng)濟都有多方面的要求。在糖尿病患者中，7500 萬人依賴胰島素治療。這些嚴(yán)重的胰島素缺乏和胰島素抵抗亞型患者需要通過注射或輸注胰島素、生活方式干預(yù)和持續(xù)血糖監(jiān)測等綜合措施嚴(yán)格控制血糖，以降低急性不良事件（高血糖和低血糖）的發(fā)生率以及心血管疾病或腎病、神經(jīng)病和視網(wǎng)膜病變等長期并發(fā)癥的發(fā)生率。雖然當(dāng)前的注射胰島素是一種廣泛使用的療法，但是依然有可能發(fā)生危及生命的低血糖事件。
來自澳大利亞悉尼大學(xué)的Nicholas J. Hunt和Victoria C. Cogger團隊利用胰島素共軛硫化銀量子點與殼聚糖/葡萄糖聚合物的涂層，開發(fā)出一種反應(yīng)靈敏的口服胰島素納米制劑。這種制劑對 pH 值有反應(yīng)，在酸性環(huán)境中不溶解，在中性 pH 值下，人體十二指腸外植體和秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）的吸收率增加。該制劑對葡萄糖苷酶敏感，可觸發(fā)胰島素釋放。研究發(fā)現(xiàn)，該制劑口服后會分布到小鼠和大鼠的肝臟，并促進血糖的劑量依賴性降低，而不會導(dǎo)致患有糖尿病嚙齒動物出現(xiàn)低血糖或體重增加。非糖尿病狒狒的血糖降低也呈劑量依賴性。在小鼠、大鼠和非人靈長類動物中未觀察到生化或血液學(xué)毒性或不良事件。該制劑顯示了口服控制血糖而不引起低血糖發(fā)作的潛力。相關(guān)工作以題為“Oral nanotherapeutic formulation of insulin with reduced episodes of hypoglycaemia”的文章發(fā)表在2024年1月2日的國際頂級期刊《Nature Nanotechnology》。
1. 創(chuàng)新型研究內(nèi)容
口服胰島素被認(rèn)為可以模擬胰島素的內(nèi)源性釋放，因此為這些挑戰(zhàn)提供了解決方案。胰腺分泌的胰島素大部分作用于肝臟，只有一小部分可避免肝臟清除而作用于全身。同樣，在口服后，口服胰島素首先通過門靜脈循環(huán)輸送到肝臟。然而，以往的口服胰島素臨床試驗表明，口服胰島素對降低低血糖發(fā)生率的作用微乎其微?？诜葝u素在長期堅持用藥和藥物可接受性方面也有一些優(yōu)勢，因為胰島素注射對于兒童、老年人和新確診的胰島素依賴型 2 型糖尿病患者來說尤其具有挑戰(zhàn)性，會導(dǎo)致他們回避、猶豫或延遲胰島素治療。此外，注射胰島素在新的治療領(lǐng)域（如認(rèn)知障礙和阿爾茨海默?。┎⒉槐徽J(rèn)為是一種可行的治療方法，而在這些領(lǐng)域，注射胰島素可能具有臨床療效。此前，本研究團隊已證明硫化銀（Ag2S）量子點（QDs）具有口服生物利用度，并能提高二甲雙胍和煙酰胺單核苷酸的吸收率、口服生物利用度和肝細(xì)胞靶向性。這些藥物本來就具有口服生物利用度，但與 QDs 共軛后，藥效提高了 100-10,000 倍，并克服了與年齡相關(guān)的藥效受損問題。本研究將這一納米技術(shù)平臺與 pH 值和酶敏感性封裝聚合物結(jié)合應(yīng)用于胰島素。
【納米載體對 pH 值敏感】
胰島素口服給藥最初面臨的挑戰(zhàn)是其在低 pH 值下的高溶解度和降解。本研究發(fā)現(xiàn)與單獨使用胰島素或 QDs 相比，將胰島素附著在 Ag2S QDs 上可降低 QD 胰島素（QD-INS）在低 pH 環(huán)境中的溶解度。利用 N-（3-二甲基氨基丙基）-N′-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）化學(xué)交聯(lián)法，將可溶性胰島素（pH 值為 3）結(jié)合到用 3-巰基丙酸（3-MPA）封端的 Ag2S QDs [直徑為 6.5 ± 1.2 nm（通過透射電子顯微鏡（TEM）測量）]表面（圖 1a）。胰島素的附著是在 pH 值為 9 的條件下進行的，生成的是可溶的 QD-INS 溶液。透析后，可溶性 QD-INS 溶液的 pH 值為 7。傅立葉變換紅外光譜（FTIR）顯示，在透析過程中去除游離胰島素后，QD-INS 具有與單獨胰島素相似的峰值，表明其附著。CS/GS 的化學(xué)結(jié)構(gòu)是通過一維 1H 和二維 [1H,1H] 核奧弗霍塞爾效應(yīng)光譜（NOESY）、核磁共振和傅立葉變換紅外光譜確定的（圖 1b）。在傅立葉變換紅外光譜中，β-1,4 糖苷鍵非常突出，這是因為使用了脫乙?；瘹ぞ厶牵ㄆ咸前穯误w），它們通過這些 β-1,4 糖苷鍵聚合。葡萄糖單體在形成糖原或淀粉時通常會形成 α-1,4 或 α-1,6 糖苷鍵；但在長鏈中，它們也可以形成 β-1,4 糖苷鍵，從而形成纖維素。CS/GS 似乎同時含有 α 和 β 糖苷鍵，因此在設(shè)計時就考慮到了這種降解形式，其分解會導(dǎo)致胰島素的釋放。
在 pH 值為 7 時，由于 QD-INS 的負(fù)ζ電位和 CS/GS 的正ζ電位，QD-INS 和陽離子共聚物通過靜電吸引將 CS/GS 包覆在 QD-INS 上。在 α 和 β 鏈的 C 端，特別是 B21、25-27 和 30，可能促進了氫鍵的形成（圖 1b）。將這些溶液混合后，形成了 20.0 ± 1.7 nm 的 CS/GS 納米粒子，在 TEM 下可觀察到其中同時含有 Ag2S QDs 和胰島素（圖 1c）。添加 CS/GS 增加了 QD-INS-CS/GS 的動態(tài)光散射測量的流體動力（HD）直徑，而ζ電位的變化可以忽略不計（圖 1d）。在具有 -OH 功能基團和胺基團的 QD-INS-CS/GS 的傅立葉變換紅外光譜和核磁共振光譜中，CS/GS 涂層消除了胰島素的指紋標(biāo)記。將 QD-INS-CS/GS 在 37 ℃ 的 pH 值為 3 的溶液中培養(yǎng)以促進聚合物降解，這種效應(yīng)是可逆的。不同濃度的胰島素在 QDs 上的負(fù)載能力表明，胰島素的最大保留率為 80%，根據(jù)摩爾比，每個 QD 上有 1-2 個胰島素分子（圖 1e）。
圖1 口服胰島素（QD-INS-CS/GS）的配制和表征
【胰島素的釋放是由 CS/GS 的酶裂解介導(dǎo)的】
為了檢查胰島素有效載荷的釋放情況，本研究在肝細(xì)胞培養(yǎng)物中與各種水解酶、低 pH 值和溫度共孵育，測量了 QD-INS-CS/GS 的碳 14 (14C) 胰島素 (14C-INS) 釋放情況。與纖維素酶或β-葡萄糖苷酶共孵育明顯提高了釋放速度，在單室中 0.5 小時內(nèi)釋放了 50%（圖 2a）。隨后，本研究使用了一個由 10 kDa 透析管隔開的雙室系統(tǒng)，只允許在第二個室中檢測游離的（非 QD 連接的）胰島素。與纖維素酶或β-葡萄糖苷酶共孵育會導(dǎo)致胰島素在 1 小時內(nèi)釋放 50%（圖 2b）。釋放率隨溫度和 pH 值的降低而增加（圖 2b），這表明 CS/GS 對酶降解，尤其是對β-葡萄糖苷酶的降解非常敏感。通過質(zhì)譜分析，釋放的胰島素主要是單體（87.5%），少量存在二聚體（11.5%）和三聚體（<1.0%）（圖 2c）。在 QD-INS 和 QD-INS-CS/GS 與單獨的胰島素之間觀察到了類似的光譜峰（圖 2c）。
本研究還在肝細(xì)胞培養(yǎng)物中評估了胰島素和蔗糖的吸收。當(dāng)與 QDs 共軛時，14C-INS 的攝取量增加了一倍，而與 QD-INS-CS/GS 共軛的制劑則逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)（圖 2d），這表明 CS/GS 與受體激活關(guān)鍵的 β 鏈 C 末端發(fā)生了相互作用。用 QD-INS-CS/GS 或 QD-INS-CS/GS 釋放的胰島素預(yù)處理肝細(xì)胞，突出表明 CS/GS 必須在胰島素作用前降解，并顯示 QD-INS 具有生理活性（圖 2e）。
圖2 QD-INS-CS/GS 的胰島素釋放量
【納米載體提高人體腸道外植體的吸收率】
本研究使用人十二指腸外植體研究了腸道攝取情況，這與本研究團隊之前在小鼠體內(nèi)的研究類似。人十二指腸外植體細(xì)胞攝取的實時成像（圖 3a）顯示，2-4 分鐘內(nèi)的活體攝取主要集中在細(xì)胞質(zhì)中（70%）（圖 3b）。8 分鐘后觀察到內(nèi)泡形成和外排。用 QD-INS-CS/GS 配制后，人十二指腸外植體對 14C-INS 的吸收率提高了 40 倍（圖 3c）。
【胰島素納米載體促進秀麗隱桿線蟲的脂肪儲存】
本研究還在秀麗隱桿線蟲（C. elegans）中對腸道吸收進行了驗證。由于其腸道屏障和對胰島素的生理反應(yīng)，該模型可用于口服給藥納米技術(shù)的初步篩選。過量的胰島素會抑制體內(nèi)儲存脂肪的釋放和能量利用，促進脂肪儲存。本研究觀察到，與對照組相比，20 µg ml-1 QD-INS-CS/GS 與 OP50 大腸桿菌（大腸桿菌）以 1:1 的比例混合 24 小時的高劑量會增加前部脂肪儲存（圖 3d,e）。
圖3 十二指腸外植體對 QD-INS(488)-CS/GS 的吸收率
【納米載體提高了小鼠的生物利用度和療效】
使用 14C-INS 評估了皮下注射胰島素（SC-INS）和口服 QD-INS-CS/GS （20 IU kg-1）的生物分布。在 C57BL/6J 小鼠體內(nèi)，QD-INS-CS/GS 的 Cmax 值為 0.06 IU ml-1，Tmax 值為 0.5 小時，T½ 值為 0.5 小時；相比之下，SC-INS（2 IU kg-1）的 Cmax 值為 0.1 IU ml-1，Tmax 值為 0.25 小時，T½ 值為 0.25 小時。根據(jù)血藥濃度計算，口服 QD-INS-CS/GS 的生物利用度為 4%（圖 4a）。
本研究還關(guān)注了 SC-INS、QD-INS-CS/GS 和不含納米技術(shù)的口服胰島素（Oral-INS）在全血、肝臟、肌肉、脂肪、十二指腸、腎臟和脾臟中的分布情況。0.5 小時后，SC-INS 在血液、肝臟和肌肉/脂肪中的分布比例分別為 40%、40% 和 20%（圖 4b）。相比之下，QD-INS-CS/GS 在肝臟的分布比例為 20%，在腸道的分布比例為 60%（圖 4c）。2 小時后，SC-INS 和 QD-INS-CS/GS 在肝臟、小腸和腎臟的分布比例分別為 50%、20% 和 10%。SC-INS在肌肉和脂肪中的分布更多，而QD-INS-CS/GS則只針對肝臟?？诜?INS 仍留在小腸中。
通過口服葡萄糖耐量試驗（oGTT）和口服葡萄糖前 15 分鐘用 SC-INS 和口服 QD-INS-CS/GS 進行預(yù)處理，本研究關(guān)注了 C57BL/6J 小鼠的藥效學(xué)效應(yīng)。SC-INS（2 IU kg-1）和口服 QD-INS-CS/GS（20 IU kg-1）對 oGTT 曲線下面積（AUC）的降低作用相似（圖 4d）。注射和口服胰島素都出現(xiàn)了劑量依賴性效應(yīng)（圖 4b）。高劑量（5 IU kg-1）SC-INS 會引起低血糖（血糖 < 3.0 mmol l-1），而口服胰島素即使在 300 IU kg-1 的劑量下也不會引起低血糖（圖 4e）。QD-INS-CS/GS 的單個成分（QD，0.6 µg；胰島素，20 IU kg-1；CS/GS，10 µg）也通過 oGTT 進行了檢測。沒有觀察到單個材料或單獨口服胰島素（100 IU kg-1）對 AUC 有任何影響。
圖4 單劑量 SC-INS、QD-INS-CS/GS 和單獨口服胰島素的藥代動力學(xué)和藥效學(xué)研究
【胰島素納米載體在 T1D 動物模型中發(fā)揮療效】
本研究在以下 T1D 動物模型中比較了 SC-INS 和 QD-INS-CS/GS 單劑量和/或慢性治療的藥理作用：非肥胖糖尿?。∟OD）小鼠（自身免疫誘導(dǎo)的 T1D）和接受鏈脲佐菌素（STZ）（單劑量 65 mg kg-1）治療的大鼠（毒素誘導(dǎo)的 T1D）。在 NOD 小鼠中，SC-INS（1 IU kg-1）和 QD-INS-CS/GS（25 IU kg-1）都能在 15 分鐘內(nèi)降低血糖，并使 ITT AUC 降低 40%（圖 5a）。隨著劑量的增加，這兩種藥物的血糖降低也呈現(xiàn)劑量依賴性（圖 5b）。慢性 2 周 SC-INS 給藥或在飲用水中自由給藥 QD-INS-CS/GS 表明，QD-INS-CS/GS 可在治療期間維持血糖小于 11.1 mmol l-1。這種效應(yīng)在 7 天的沖洗期后逆轉(zhuǎn)（圖 5c）。經(jīng) SC-INS 治療的小鼠在治療后 1 小時血糖下降，隨后在治療后 8 小時恢復(fù)到基線水平。在重度糖尿病 STZ 大鼠（血糖 > 30 mmol l-1）中，注射胰島素和口服胰島素對血糖的降低具有相似的劑量依賴性（圖 5d）。慢性用藥是通過使用 SC-INS 或在飲用水中自由給藥 QD-INS-CS/GS 進行為期 2 周的治療。在治療期間，QD-INS-CS/GS 可將血糖維持在 15-25 mmol l-1 的較低水平，而在 3 天的沖洗期后，這種效應(yīng)消失（圖 5e）。持續(xù) 6 周的治療表明，SC-INS 大鼠的體重增加了 30%，而接受 QD-INS-CS/GS 治療的小鼠體重沒有變化（圖 5f）。這些大鼠的血清生化或血脂也沒有變化。
圖5 在 NOD 小鼠和 STZ 治療大鼠中使用 SC-INS 和 QD-INS-CS/GS（口服胰島素）進行單劑量和 2 周每日治療的藥效學(xué)研究
【胰島素納米載體在非人靈長類動物中發(fā)揮療效】
為了檢驗 QD-INS-CS/GS 在臨床應(yīng)用中的有效性和準(zhǔn)備情況，本研究對來自美國國家狒狒群落的非糖尿病狒狒進行了研究，BG 和毒性數(shù)據(jù)收集工作均獨立進行。每只狒狒都在一夜禁食后進行了 ITT；在基線和口服 1-10 IU kg-1 胰島素后收集數(shù)據(jù)（圖 6a）。使用 5 和 10 IU kg-1 的 QD-INS-CS/GS 治療可使血糖分別下降 10% 和 13%，在 15-30 分鐘內(nèi)即可觀察到效果（圖 6a）。即使在初始血糖為 2.9 mmol l-1 的狒狒子群中，單次劑量為 5 IU kg-1 的 QD-INS-CS/GS 也不會導(dǎo)致任何狒狒出現(xiàn)低血糖。對血糖為 4.9 mmol l-1 的狒狒施用相同劑量可使血糖降低 10%（圖 6c）。試驗后進行的血液生化、血脂和血液學(xué)評估顯示，沒有超出參考范圍的變化。此外，未報告任何不良事件，包括任何低血糖發(fā)作。
圖6 非糖尿病狒狒的 ITT
2. 總結(jié)與展望
總之，胰島素與帶有 CS/GS 聚合物涂層的 Ag2S QDs 共軛過程在 CSIRO 的生產(chǎn)過程簡單且具有可重復(fù)性。該產(chǎn)品促進了胰島素的口服吸收和肝臟靶向性。在小鼠、大鼠和狒狒身上，該產(chǎn)品顯示出劑量依賴性效應(yīng)，低血糖發(fā)生率降低，且無毒性。這些研究為在人體中評估這種制劑、正在進行的毒性和臨床研究奠定了基礎(chǔ)。這項技術(shù)旨在成為口服多肽給藥的平臺。它適用于作用于肝臟（如干擾素-α）或其他器官（如胰腺的胰高血糖素樣肽-1 促效劑（利拉魯肽））的多肽和蛋白質(zhì)。
文章來源：https://www.nature.com/articles/s41565-023-01565-2
京公網(wǎng)安備11010802046783號
