對于皮膚局部外用藥物，目前還沒有特定的指導原則。美國EPA和OECD倒是出過一些可能會在人體局部暴露的化學品的指南。但是，這些指南重點提及的是體外毒性測試和嚙齒類毒性研究，并未涉及非嚙齒類動物試驗。
當然，通用的指導原則也是可以用來指導皮膚外用藥物安評的。
Novartis之前分享過局部用藥的臨床前安全性評價的研究計劃。IND之前以嚙齒類+非嚙齒類的局部、系統(tǒng)短期重復給藥、遺傳毒性、安全藥理等為主，臨床期間補充更長周期一般毒理研究、生殖毒及致癌性試驗。從藥物發(fā)現(xiàn)到IND enabling、支持更長周期臨床或上市的研究示意圖如下：
縱觀皮膚外用制劑的非臨床研究內(nèi)容，除參考傳統(tǒng)口服給藥制劑的思路設計試驗外，在一般毒、致癌、PK部分需要額外考察皮膚外用引入的風險。涉及系統(tǒng)給藥這部分比較傳統(tǒng)的設計相對常規(guī)、多見，不再展開。重點介紹下皮膚外用相關的特殊考量點。
為什么小型豬是皮膚外用制劑的最常用種屬，而不是犬或者猴？
如下圖所示，小型豬在表皮特征、厚度、汗腺分布、皮脂腺、淺表血管叢等方面與人體更為接近。在皮膚代謝、生理學（如皮膚滲透）等方面與人體也較非人靈長類或犬更為接近。兔子之前也被用于藥物的皮膚毒性評價，但目前已經(jīng)很少使用，因其皮膚的解剖和生理學特點與人體相關性較差，往往會過度高估毒性。因此，小型豬是皮膚外用制劑的首選非嚙齒類研究種屬。常用的小型豬的種系主要包括the Sinclair (Hormel), the Yucatan, the Hanford, the Göttingen. 從皮膚顏色、體重增長速率等角度考量，the Göttingen是最常用的種系，且隨著使用的增加，該種系逐漸積累了豐富的歷史對照背景數(shù)據(jù)，得到了進一步推廣，有點類似滾雪球效應。
小型豬一般毒理研究的試驗方案設計關注點
1、劑量設計、給藥頻率
劑量設計可以參考ICH M3，應該達到人體暴露量的數(shù)倍。理想的情況是，低劑量未出現(xiàn)系統(tǒng)毒性、未出現(xiàn)局部毒性或輕微局部毒性。高劑量則建議出現(xiàn)一定的系統(tǒng)毒性，伴隨或不伴隨輕微的局部毒性。FDA建議將皮膚刺激性試驗伴隨在一般毒理試驗中開展。需要重點提醒的是，由于注射部位空間大小、高濃度制劑制備難度等條件限制，高劑量通常用MFD（Maximum feasible dose）劑量。MFD確定通常需要先開展預試驗，在給藥部位以0.5mL/kg的體積先進行覆蓋，假如這一體積無法完整覆蓋給藥部位，則可以再增加0.5mL/kg的體積，最多累積到2mL/kg，但通常0.5-1mL/kg操作可行性較高。另外，不同劑量之間，通常給藥體積相同，通過調(diào)節(jié)給藥濃度實現(xiàn)不同給藥劑量的藥物遞送。
給藥頻率和暴露持續(xù)時間要視臨床擬用暴露量而定。通常是每天用藥1次，也偶見2次或更高頻率。大多數(shù)情況，藥物需要持續(xù)暴露，也有間歇暴露情況，比如只暴露4-6h。這種情況需要將皮膚表面的藥物按時清除。
2、給藥部位
小型豬的給藥部位通常在背部區(qū)域脊柱兩側(cè)的位置。給藥部位面積至少要達到體表面積的10%。為實現(xiàn)這一給藥體積，從肩胛骨到髖骨的區(qū)域，以及動物兩側(cè)側(cè)面的一半，都應該剃光。
小型豬體表面積計算公式：10%體表面積=70*（公斤體重）0.75
經(jīng)計算后，10、12kg的小型豬的體表面積分別為394、451cm2
給藥前需要對小型豬的毛發(fā)進行修剪和必須的剔除，并注意避免傷害到皮膚。如果是用于傷口治療的藥物，則需要用手術刀根據(jù)要求制造傷口。關于這部分，F(xiàn)DA有具體指南要求，可以參考A specific FDA Guidance for Industry discusses considerations for evaluation of chronic cutaneous ulcer and burn wounds。
下一步就是將藥物均勻的涂抹至給藥部位。之后，為了降低動物口部接觸的風險，并最大程度模擬臨床，通常會采用半封閉的透氣材料覆蓋，模擬臨床衣物接觸的情況。已有市售的動物T恤上市，比如下圖中的Lomir T-shirt。
完成藥物暴露后，先用溫和的清潔劑（如Cetaphil）清洗，然后用自來水沖洗（至少兩次），并用棉布吸干。
3、防止交叉污染
由于藥物是外用給藥，給藥組小型豬如果摩擦圍欄，有可能使陰性組動物被藥物污染。因此，給藥組和對照組動物要有足夠的隔離空間，或分屋飼養(yǎng)。試驗操作時盡量從空白組開始。技術人員在操作時要經(jīng)常更換防護服和手套，并盡量避免接觸給藥表面。
4、給藥持續(xù)時間
與其它類型藥物類似，給藥持續(xù)時間要覆蓋臨床給藥周期，非嚙齒類最長給藥周期約9個月，如果是生物藥物，最長6個月也是可以接受的。
5、檢測指標
局外皮膚外用制劑需要采用打分系統(tǒng)考察藥物對皮膚的作用。常用Draize系統(tǒng)評估皮膚刺激性。
其它指標評價如臨床觀察、體重、ECG、眼科檢查、血生化、血常規(guī)、尿液分析等則與其它類型藥物類似，不再贅述。
6、大體解剖和組織病理學檢查
大體解剖時對皮膚應進行認真、仔細的檢查，可以結(jié)合一般臨床觀察的結(jié)果一起評估。比如一般臨床觀察看到因血管充血導致的red discoloration會因解剖放血而消失，導致觀察不到。除了對給藥部位取材，未給藥部位也應取材作為對照，未給藥部位皮膚取材與給藥部位的皮膚厚度和毛囊密度具有可比性。另外，不僅要考察對給藥部位皮膚造成的局部毒性，還要考慮藥物進入系統(tǒng)暴露后對其它部位皮膚的影響。通常對腹股溝部位的皮膚進行采集。
如果要做皮膚中藥物濃度的TK檢測，可以在皮膚固定之前，收集一部分完整厚度的皮膚。
組織病理學檢查除按照常規(guī)要求對各臟器進行取材、鏡檢外，由于藥物直接給到皮膚表面，通過皮膚吸收，需要對皮膚標本進行重點考察，包括毛囊、大汗腺、皮脂腺等。
案例分享
局部外用藥OPZELURA的非臨床研究內(nèi)容
Ruxolitinib是一款小分子JAK1和JAK2抑制劑，2022年7月FDA批準上市，局部外用治療白癜風及特應性皮炎。先看下這款產(chǎn)品的非臨床研究開展了哪些試驗？
體外藥效部分比較常規(guī)，開展的傳統(tǒng)的體外酶活、細胞活性、信號通路等研究。體內(nèi)則采用了3種不同的藥效模型開展的研究，次要藥效學主要考察的藥物脫靶作用。安全藥理部分也是傳統(tǒng)的體外鉀離子通道及體內(nèi)三大系統(tǒng)研究。藥代動力學除開展口服藥物的ADME研究外，額外開展了小型豬的臨床擬用途徑的皮膚組織分布研究。
毒理部分開展的研究非常多，大致分為一般毒理、遺傳毒理、致癌性、生殖毒和其它毒性。一般毒理采用的是兩種屬系統(tǒng)暴露給藥、一個種屬即小型豬的皮膚外用給藥。遺傳毒和生殖毒比較常規(guī)，不贅述。致癌性則是結(jié)合短周期轉(zhuǎn)基因鼠+傳統(tǒng)2年長周期組合的方案。由于臨床擬用于12歲及以上人群，因此開展了幼齡動物的毒性研究。其它毒性主要涉及皮膚外用導致的刺激、過敏和光毒性風險。
最后
皮膚局部外用制劑的非臨床研究之前有朋友私下討論過，也有很多朋友對這個話題感興趣，所以簡單寫了一期相關主題的文章。這類產(chǎn)品相較于傳統(tǒng)系統(tǒng)給藥制劑，最大的區(qū)別是在考量系統(tǒng)暴露的同時，需重點關注局部直接接觸皮膚后引入的毒性風險，既包括一般毒性、也包括致癌性。除此以外，需要研究清楚局部外用后的PK變化，比較核心的是局部給藥局部發(fā)揮作用的制劑，靶部位是皮膚，那么靶部位的藥物暴露需要研究清楚，這點無論對于支持毒理學結(jié)果解釋，還是臨床劑量設計，都是有意義的。其它研究內(nèi)容，如主要藥效學研究、安全藥理學研究、生殖毒性研究，可參考系統(tǒng)給藥制劑。雖然指導皮膚局部外用制劑非臨床研究的法規(guī)文件不多，但好在可參考的已上市藥物還挺多，可以結(jié)合自己產(chǎn)品的特點，科學合理設計非臨床研究策略。
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