1. 背景介紹
方法驗(yàn)證的目的是驗(yàn)證方法可以符合預(yù)期使用的目的。有關(guān)物質(zhì)方法驗(yàn)證，即驗(yàn)證該有關(guān)物物質(zhì)方法可以準(zhǔn)確有效的對(duì)某種物料或者產(chǎn)品中有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)和定量。按照ICH Q2（R1）分析方法論證：正文和方法學(xué)和中國(guó)藥典9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，需要對(duì)以下指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證：專屬性，線性，范圍、準(zhǔn)確度、精密度（重復(fù)性、中間精密度）、檢測(cè)限、定量限、耐用性和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。以上驗(yàn)證指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)均滿足要求則方法驗(yàn)證通過(guò)，也就是符合預(yù)期使用的目的。那標(biāo)準(zhǔn)如何設(shè)定？本文將對(duì)各指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)制定進(jìn)行討論，本文內(nèi)容為筆者經(jīng)驗(yàn)之談，如有不正確的地方，還請(qǐng)各位同仁予以指正。
2. 有關(guān)物質(zhì)方法驗(yàn)證指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)的制定
2.1. 耐用性和系統(tǒng)適用性
耐用性通常情況下應(yīng)當(dāng)在方法開(kāi)發(fā)的時(shí)候進(jìn)行，進(jìn)行周密的方法設(shè)計(jì)，以保證方法的參數(shù)處于中間值，使方法具有好的耐用能力，對(duì)日后的放行，穩(wěn)定性乃至標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核時(shí)能更加順利。一個(gè)好的方法應(yīng)當(dāng)具有良好的耐用性，尤其是有關(guān)物質(zhì)方法，在方法參數(shù)存在微小變動(dòng)的情況下，仍能夠有效的對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行定量，定量的基本前提需要滿足系統(tǒng)適用性要求，所以耐用性的指標(biāo)應(yīng)當(dāng)與系統(tǒng)適用性要求一致，如理論板數(shù)、拖尾因子、信噪比、系統(tǒng)精密度、分離度以及峰谷比。
理論板數(shù)：如規(guī)格為250mm×4.6mm，5μm或者150mm×4.6mm，3.5μm色譜柱，通常建議不低于1500，此外還應(yīng)注意理論板數(shù)和保留時(shí)間（tR）呈正比，保留時(shí)間越小，理論板數(shù)越小。
拖尾因子：參考USP<621>，如果為含量測(cè)定，應(yīng)在0.8-1.8之間，避免拖尾或者前延對(duì)定量造成影響。
信噪比：雜質(zhì)測(cè)定時(shí)，為保證檢測(cè)時(shí)儀器當(dāng)下的狀態(tài)可以有效檢出雜質(zhì)，通常使用報(bào)告限水平溶液，信噪比應(yīng)不低于10。
系統(tǒng)精密度：在考察樣品溶液之前，需要對(duì)對(duì)照溶液進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，通常測(cè)定6次，RSD%應(yīng)不大于5.0%，如果限度特別低，如基因毒性雜質(zhì)檢測(cè)到，可以考慮適當(dāng)放寬。
分離度：選擇較難分離的一對(duì)雜質(zhì)峰，或者主成分峰與相鄰雜質(zhì)峰，要求不小于1.5?？梢允褂锰砑与s質(zhì)的樣品溶液，或者使用正常樣品溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕到狻?/span>
峰谷比：如果兩峰之間不能夠達(dá)到基線分離，軟件識(shí)別不到5%峰高處的峰寬，無(wú)法計(jì)算分離度時(shí)，可以采用該指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估。雖然不能達(dá)到基線分離，但在采用指標(biāo)評(píng)估時(shí)，方法的準(zhǔn)確度，精密度都能夠滿足要求。峰谷比考察的溶液同分離度考察溶液。
耐用性還應(yīng)進(jìn)行溶液穩(wěn)定性研究，對(duì)照溶液可參考系統(tǒng)精密度%RSD不大于5.0%，樣品溶液可參考重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)。如果樣品存在前處理，例如超聲提取或者衍生等過(guò)程，也應(yīng)該進(jìn)行相應(yīng)考察，應(yīng)符合樣品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
2.2. 專屬性
專屬性考察，應(yīng)進(jìn)行各雜質(zhì)定位的考察，稀釋劑和輔料溶液的干擾，如為梯度方法還應(yīng)考察梯度空白的影響以及添加雜質(zhì)樣品溶液的研究，應(yīng)對(duì)各溶液的典型色譜圖進(jìn)行報(bào)告，要求稀釋劑，輔料溶液和空白梯度峰不存在干擾，添加雜質(zhì)樣品溶液中，雜質(zhì)峰與主峰的分離度應(yīng)不低于1.5，雜質(zhì)之間如果存在較難分離的情況，也可進(jìn)行適當(dāng)控制，但可以標(biāo)準(zhǔn)可以適當(dāng)放寬，但前提應(yīng)保證可以準(zhǔn)確定量和重現(xiàn)。
專屬性中還應(yīng)進(jìn)行降解研究考察，以證明方法具有穩(wěn)定性指示功能，對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕到?，模擬在穩(wěn)定性末期可能會(huì)出現(xiàn)的雜質(zhì)，即穩(wěn)定性末期存在較多雜質(zhì)的樣品，該方法仍能夠有效分離定量雜質(zhì)。降解條件包括酸、堿、氧化、高溫、光照。其中光照條件可參照ICH要求進(jìn)行，如果產(chǎn)品對(duì)光比較敏感，存在二次降解，可降低累計(jì)光強(qiáng)度和紫外照度，同時(shí)放置控制樣品進(jìn)行比對(duì)考察。其他條件應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)难芯窟M(jìn)行確定，但需要注意并非所有條件都要有降解，可能某些物質(zhì)對(duì)某些條件并不敏感，我們不必過(guò)度研究。建議合理的降解程度為10%左右，并使物料守恒能夠滿足90%-110%，主峰的純度應(yīng)良好，不能有共流出物。
2.3. 檢測(cè)限和定量限
定量限為當(dāng)下方法能夠滿足定量的最低限度，因?yàn)槎康幕|(zhì)為樣品溶液，所以如果僅對(duì)雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行要求信噪比不低于10，不具有實(shí)際意義，因此應(yīng)當(dāng)保證定量限水平的雜質(zhì)在樣品溶液中可以準(zhǔn)確定量，所以應(yīng)結(jié)合準(zhǔn)確度研究進(jìn)行定量限的確定。因此定量限要求信噪比不低于10，還要求定量限水平的準(zhǔn)確度滿足要求，此外，定量限應(yīng)不大于忽略限/報(bào)告限（通常為0.05%，參考ICH設(shè)定）。檢測(cè)限要求信噪比不低于3即可。
2.4. 線性與范圍
有關(guān)物質(zhì)的研究范圍應(yīng)從定量限（≤忽略限/報(bào)告限）至150%或者更高，要求相關(guān)系數(shù)應(yīng)不小于0.99，y軸截距不大于100%濃度水平峰面積的10%，在計(jì)算校正因子時(shí)，應(yīng)注意扣除酸基和堿基以及純度的折算，校正因子在0.9-1.1之間不需要進(jìn)行校正。
2.5. 精密度
如果樣品中雜質(zhì)含量較低，應(yīng)使用添加雜質(zhì)樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，平行制備6份，進(jìn)行重復(fù)性考察，中國(guó)藥典中9101的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于嚴(yán)格，審評(píng)中也不會(huì)按照該尺度執(zhí)行，可以參考藥品GMP指南第2版的 標(biāo)準(zhǔn)：檢測(cè)值<0.1%：RSD≤25%；0.1%≤檢測(cè)值<0.2%：RSD≤20%；0.2%≤檢測(cè)值<0.5%：RSD≤10%；0.5%≤檢測(cè)值<5%：RSD≤5%；5%<檢測(cè)值：RSD≤2.5%；中間精密度因?yàn)橥粚?shí)驗(yàn)室，僅不同人在不同天使用不同儀器實(shí)驗(yàn)，也可以參照此標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。
2.6. 準(zhǔn)確度
在樣品基質(zhì)中添加已知量的雜質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確度研究，應(yīng)至少研究3個(gè)水平，建議為定量限水平，限度水平，以及一個(gè)高水平，每個(gè)水平平行制備3份準(zhǔn)確度溶液?；厥章士刂圃?0-120%之間，LOQ根據(jù)情況可適當(dāng)放寬，如果雜質(zhì)水平較高，應(yīng)當(dāng)適當(dāng)收緊。如果樣品溶液中本底過(guò)高，可能會(huì)存在超出范圍的情況，應(yīng)盡可能的獲取雜質(zhì)含量低的樣品。如果不可獲得，可以適當(dāng)降低樣品濃度以減小本底的干擾。
3. 結(jié)論
有關(guān)物質(zhì)方法驗(yàn)證是非常重要的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，各國(guó)的審計(jì)都非常關(guān)注，我們也應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注，驗(yàn)證之前，方法開(kāi)發(fā)的工作一定要充分，并進(jìn)行預(yù)驗(yàn)證工作，避免驗(yàn)證時(shí)候出現(xiàn)異常。驗(yàn)證最終的目的不是通過(guò)驗(yàn)證，而是獲得一個(gè)可以有效分離能夠準(zhǔn)確定量雜質(zhì)的方法。望本文對(duì)您有所幫助。
參考文獻(xiàn)：
1. ICH Q2（R1）分析方法論證：正文和方法學(xué)
2. 中國(guó)藥典9101分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則
3. ICH Q1B 穩(wěn)定性試驗(yàn)：新原料藥和制劑的光穩(wěn)定性試驗(yàn)
4. ICH Q3A（R2）新原料藥中的雜質(zhì)
5. ICH Q3B（R2）新藥制劑中的雜質(zhì)
6. 藥品GMP指南 第2版 質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室與物料系統(tǒng)
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
