近年來寡核苷酸藥物成為新藥研發(fā)中備受關(guān)注的分子類型，被認(rèn)為是繼小分子化藥、抗體藥物之后的第三代治療藥物。寡核苷酸是指含有約20個堿基的短鏈核苷酸，通過以Watson-Crick堿基互補配對的原理與mRNA互補鏈結(jié)合，作用于轉(zhuǎn)錄和翻譯。根據(jù)結(jié)構(gòu)和作用機理不同，分為反義寡核苷酸（ASO）、小干擾RNA（siRNA）、小激活RNA（saRNA）、微小RNA (miRNA)、適配體(Aptamer)等。
由于siRNA藥物療效較好且技術(shù)取得突破，這使得它成為目前最受關(guān)注的核酸藥物之一。siRNA是一類雙鏈RNA分子（反義鏈、正義鏈），通過與體內(nèi)相關(guān)酶形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex, RISC）來降解目標(biāo)mRNA，以此來下調(diào)或抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。2024年伊始，siRNA藥物領(lǐng)域的合作捷報頻傳：1月3日，勃林格殷格翰宣布與蘇州瑞博及其瑞典子公司Ribocure達(dá)成合作協(xié)議，共同開發(fā)治療非酒精性或代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎的小核酸創(chuàng)新療法。1月7日，舶望制藥宣布與諾華就RNAi療法達(dá)成兩項獨家許可合作協(xié)議。
截至目前，F(xiàn)DA共批準(zhǔn)6款siRNA上市藥物。值得一提的是，其中有4款來自Alnylam，1款來自Alnylam與諾華共同開發(fā)，1款來自諾和諾德，治療領(lǐng)域主要為內(nèi)分泌與代謝、神經(jīng)、泌尿、心血管系統(tǒng)。6款藥物均靶向肝臟，并進行了化學(xué)修飾。除了Onpattro遞送方式為LNP（脂質(zhì)納米粒），并且給藥方式為靜脈輸注外，其它藥物的遞送系統(tǒng)均為GalNAc，給藥方式均為皮下注射，詳見表1。
表1六款siRNA上市藥物（截止2024.1）
由于siRNA自身的物理化學(xué)特性，未經(jīng)修飾的siRNA給藥后不僅會很快被機體清除，同時還有脫靶毒性的風(fēng)險。因此，需要同時借助化學(xué)修飾和合適的遞送系統(tǒng)來達(dá)到治療目的。已上市的6款siRNA藥物均使用了化學(xué)修飾和遞送系統(tǒng)。第一代化學(xué)修飾是對磷酸骨架的修飾，如硫代磷酸酯（PS）。第二代化學(xué)修飾是核糖修飾，其中2-O-甲基（2-OMe）、2-O-甲氧基-乙基（2-MOE）和2-氟（2-F）修飾是最常用的類型。第三代化學(xué)修飾為核糖五元環(huán)改造。經(jīng)過化學(xué)修飾后，共同的特點是增加了siRNA的穩(wěn)定性，但同時也存在一些缺點，如經(jīng)PS修飾后降低與靶基因結(jié)合的親和力，與某些蛋白的非特異性相互作用可能引起細(xì)胞毒性。
單純通過化學(xué)修飾還是很難使siRNA到達(dá)靶部位。因此，遞送系統(tǒng)是寡核苷酸藥物研發(fā)中成功的關(guān)鍵因素，也是藥物研發(fā)公司的技術(shù)護城河。目前已上市的6款siRNA藥物，只有Patisiran遞送系統(tǒng)是LNP（圖1左），其余的遞送系統(tǒng)均為GalNAc（圖1右）。LNP主要由4部分組成：可電離脂質(zhì)、膽固醇、輔助磷脂、PEG-脂質(zhì)。其中，可電離脂質(zhì)是最關(guān)鍵的輔料，它在不同的pH條件下表現(xiàn)出不同的帶電特征，酸性pH值條件下帶正電荷，而在生理pH條件下基本呈中性，可離子化特性為siRNA跨越生物屏障提供了智能化的保護。5款GalNAc-siRNA偶聯(lián)物均使用L96作為載體，該結(jié)構(gòu)由三部分組成，包括三觸GalNAc靶頭、連接臂以及siRNA分子。GalNAc以三價態(tài)的方式共價偶聯(lián)至核酸3’末端，形成GalNAc-siRNA偶聯(lián)物。GalNAc是去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的配體，ASGPR在肝細(xì)胞的膜表面高度特異性表達(dá)。GalNAc-siRNA偶聯(lián)物通過特異性結(jié)合ASGPR，在內(nèi)吞作用下將siRNA從細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運至細(xì)胞中。隨后GalNAc-siRNA偶聯(lián)物與ASPGR分離，ASPRGR回到細(xì)胞表面，而GalNAc-siRNA偶聯(lián)物進一步解離，釋放出的游離siRNA在細(xì)胞質(zhì)中沉默基因以發(fā)揮藥效。
圖1 遞送系統(tǒng)LNP, GalNAc及作用機制
siRNA藥物化學(xué)合成藥物，雖具備生物制品屬性，但按新化學(xué)實體監(jiān)管。所以不僅在科學(xué)認(rèn)知上存在一些缺口，也存在一些監(jiān)管指南空缺。目前中國尚無相關(guān)指導(dǎo)原則。除了ICH系列指導(dǎo)原則外（ICH S6/M3/S7/S2/S8）,日本PMDA 2020年發(fā)布了《寡核苷酸治療產(chǎn)品非臨床安全性評價指導(dǎo)原則》可供參考；FDA也發(fā)布了用于工業(yè)界的相關(guān)指導(dǎo)原則，如《寡核苷酸治療藥物開發(fā)的臨床藥理學(xué)考慮》等。根據(jù)日本PMDA發(fā)布的《寡核苷酸治療產(chǎn)品非臨床安全性評價》指導(dǎo)原則，siRNA藥物需要2個種屬進行臨床前安全性評價，嚙齒類為大鼠或者小鼠，非嚙齒類一般為食蟹猴。目前已上市的6款siRNA，非嚙齒類均是食蟹猴，嚙齒類分別為大鼠（5款）、小鼠（Nedosiran）。非嚙齒動物選擇猴的主要原因如下：猴和人的目標(biāo)mRNA具有高度或完全同源性，而且猴種屬可以更好地評估siRNA放大的藥理學(xué)效應(yīng)，比如Inclisiran核苷酸序列與人和猴PCSK9中的類似序列完全同源，且用猴開展藥效。siRNA藥物臨床前評價動物種屬選擇見圖2。
圖2 siRNA藥物臨床前評價動物種屬選擇
根據(jù)已上市的6款siRNA藥物申報資料，臨床前開展的安全性評價試驗總結(jié)如表2。
表2六款siRNA藥物臨床前安評試驗總結(jié)
考慮到已上市的6款siRNA藥物臨床前毒理數(shù)據(jù)較多，僅以遞送系統(tǒng)為LNP的藥物Patisiran，遞送系統(tǒng)為GalNAc的藥物Inclisiran為代表，分析臨床前安評結(jié)果。Patisiran是Alnylam研發(fā)，于2018.8 FDA批準(zhǔn)上市的首款siRNA藥物。適應(yīng)癥為遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）引起的周圍神經(jīng)病變疾病，靶點TTR（轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白）基因。臨床給藥為靜脈滴注，3周一次, 0.3 mg/kg。遞送載體為LNP。作用機制是通過RNA干擾引起突變型和野生型TTR mRNA的降解，從而導(dǎo)致血清TTR蛋白和組織中TTR蛋白沉積的減少，達(dá)到治療疾病的目的。Patisiran臨床前安評結(jié)果如表3。
表3 Patisiran臨床前安評總結(jié)（備注：如26W+12W表示26周給藥，伴隨12周恢復(fù)期）
表3 Patisiran臨床前安評總結(jié)（續(xù)）
Inclisiran研發(fā)公司Novartis/Alnylam，于2020.12歐盟首次獲批，全球首個siRNA降膽固醇療法藥物，適應(yīng)癥原發(fā)性高膽固醇血癥或混合性血脂異常，靶點PCSK9。臨床給藥途徑為皮下注射，第0、3個月各給藥一次后，維持期6個月一次，一年只需2次。遞送系統(tǒng)為GaINAc，作用機制是與編碼PCSK9蛋白的mRNA結(jié)合，通過RNA的干擾作用來防止肝臟生成PCSK9蛋白，從而達(dá)到降低血脂的目的。Inclisiran臨床前安評結(jié)果總結(jié)如表4。
表4 Inclisiran臨床前安評總結(jié)
表4 Inclisiran臨床前安評總結(jié)（續(xù)）
為了探究已上市的6款siRNA非臨床毒性和臨床主要不良反應(yīng)是否有關(guān)聯(lián)性，通過整理支持NDA的NHP長毒試驗毒性結(jié)果，以及臨床警告和注意事項，得出非臨床和臨床關(guān)聯(lián)性較強的是肝臟毒性，需要關(guān)注血生化一些指標(biāo)變化，如ALT, AST，可在臨床階段進行密切監(jiān)控。具體情況見表5。
表5 六款siRNA藥物非臨床和臨床毒性關(guān)聯(lián)性分析（*：數(shù)據(jù)來源于支持NDA的NHP長毒試驗）
因為siRNA藥物具備大分子藥物屬性，所以也需要進行免疫毒性考察。對已上市的6款siRNA藥物免疫毒性進行總結(jié)，如抗藥抗體（ADA）、細(xì)胞因子(CKs)、補體、免疫表型(IPT)。具體結(jié)果見表6。
表6六款上市siRNA藥物免疫毒性總結(jié)(“-”表示未披露)
理論上講，若siRNA和靶mRNA準(zhǔn)確地結(jié)合在一起，則可成功的沉默靶基因。然而，許多siRNA都存在脫靶，并且大多數(shù)siRNA分子可能并不具有靶向性。siRNA的引入可導(dǎo)致脫靶效應(yīng)，即抑制目標(biāo)基因以外的其他基因，導(dǎo)致非靶基因表達(dá)突變的意外后果。根據(jù)日本藥品醫(yī)療器械管理局（PMDA）發(fā)布的《寡核苷酸治療產(chǎn)品非臨床安全性評價指導(dǎo)原則》，寡核苷酸的毒性分析分為靶向毒性、脫靶毒性，詳細(xì)見圖3。
圖3 siRNA藥物毒性分類
肝臟是siRNA藥物最關(guān)注的器官。關(guān)于肝臟毒性，通過總結(jié)已上市的6款siRNA藥物，將從藥物特點、藥代、病理進行綜合性分析。藥物特點方面，6款siRNA藥物靶點均與肝臟相關(guān)，在肝臟中合成或表達(dá)；均進行了化學(xué)修飾，如經(jīng)硫代磷酸脂修飾后可能導(dǎo)致高蛋白結(jié)合的肝毒性；遞送系統(tǒng)無論是LNP或GalNAc均有肝靶向性。目前LNP-siRNA藥物Patisiran靜脈給藥后80%~90%的LNP會進入肝臟，最終被肝細(xì)胞吸收；GalNAc-siRNA經(jīng)ASGPR介導(dǎo)發(fā)生細(xì)胞內(nèi)吞而進入靶組織，ASGPR在肝細(xì)胞上大量表達(dá)。藥代方面，組織分布結(jié)果均顯示肝臟濃度最高，如Lumasiran猴10mg/kg時，AUC高達(dá)76700h*μg/mL,且消除半衰期長，高達(dá)409h。用于支持NDA的猴長毒試驗中，組織病理均發(fā)現(xiàn)肝臟變化，從輕到重依次是：（1）肝細(xì)胞/枯否細(xì)胞嗜堿性顆粒：可能為供試品或其代謝產(chǎn)物，也可能是細(xì)胞攝取寡核苷酸的適應(yīng)性改變；（2）肝細(xì)胞空泡化：可能為繼發(fā)于胞漿內(nèi)嗜堿性顆粒蓄積的改變；（3）炎癥浸潤：高濃度藥物分布時，會激活促炎性通路（4）肝細(xì)胞單細(xì)胞壞死：高劑量下嗜堿性顆粒大量蓄積時可觀察到病理損傷。此外，大部分藥物還伴隨血生化臨檢指標(biāo)變化，如ALT, AST升高。組織的病變是否為有害變化，要根據(jù)組織本身的損傷，相關(guān)指標(biāo)的變化，可恢復(fù)情況，以及其它的siRNA藥物是否有類似改變等綜合判斷。
除了肝毒性，序列相關(guān)引起的脫靶毒性還有免疫刺激反應(yīng)，其毒性在很大程度上取決于核苷酸序列設(shè)計和化學(xué)修飾。siRNA藥物通過激活先天免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致注射部位反應(yīng)(如Patisiran，Inclisiran)、血小板（PLT）減少(如Patisiran, Givosiran)。免疫刺激評估，除了體內(nèi)試驗相關(guān)指標(biāo)的檢測，也可在體外用分離的外周血單核細(xì)胞或全血測定預(yù)測細(xì)胞因子釋放來評估。
非雜交相關(guān)的脫靶毒性，如凝血功能改變，siRNA藥物通過抑制凝血級聯(lián)反應(yīng)中的因子IXa和輔助因子VIIIa，進而選擇性的抑制了部分凝血酶的作用時間，從而以一種與雜交和序列無關(guān)的方式抑制凝血（如Patisiran，Lumasiran APTT輕微升高）。此外，siRNA藥物還可以結(jié)合抑制性因子H激活補體旁路，補體過度激活可使補體功能改變，引發(fā)繼發(fā)性炎癥和血管炎等（如Patisiran C3a升高，發(fā)現(xiàn)肝臟炎癥浸潤、輸注部位血管周圍炎癥）。
除了關(guān)注siRNA藥物本身外，還要關(guān)注遞送系統(tǒng)毒性，如LNP。LNP含有新的輔料，或成分比例發(fā)生了改變，需要對LNP進行考察。雖然沒有專門針對LNP的指導(dǎo)原則，但可以參考相關(guān)指導(dǎo)原則，如《新藥用輔料非臨床安全性評價指導(dǎo)原則》、《納米藥物非臨床安全性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》、《Guidance for Industry : Liposome Drug Products Chemistry, Manufacturing, and Controls; Human Pharmacokinetics and Bioavailability; and Labeling Documentation》等。此外，還可以參考Patisiran關(guān)于LNP的考察。若LNP是按非單獨輔料注冊標(biāo)準(zhǔn)申報，且考慮到siRNA需要兩種動物種屬，可按與非臨床安全性評價中相同的動物種屬伴隨或單獨考察LNP。IND申報LNP需要開展的毒理試驗推薦見表7。
表7 LNP毒理IND評價(非單獨輔料注冊標(biāo)準(zhǔn))
據(jù)報道，siRNA藥物發(fā)展方向依然主要集中在遞送系統(tǒng)、修飾、脫靶效應(yīng)、適應(yīng)癥拓展方向，且相輔相成。比如在遞送系統(tǒng)方面，Alnylam開發(fā)了一種連接到siRNA的短脂質(zhì)鏈——C16偶聯(lián)物，使其能被多種類型細(xì)胞吸收(CNS,肺，眼等)，從而拓展了siRNA類藥物適應(yīng)癥；新的遞送平臺GalAhead™和PDoV-GalNAc提供了更高的遞送效率。在修飾方面，例如增強穩(wěn)定性化學(xué)(ESC)，很多在研項目已經(jīng)開始使用了。關(guān)于脫靶應(yīng)在藥物設(shè)計時就考慮，而不是通過毒理評估。如Alnylam公司對siRNA脫靶預(yù)測，淘汰不符合要求的siRNA序列。
2018年，第一款siRNA藥物Onpattro的批準(zhǔn)上市對siRNA藥物領(lǐng)域產(chǎn)生了重大影響，標(biāo)志著諾貝爾獎成果已從理論概念轉(zhuǎn)變?yōu)閷嶋H治療用途，這是一個引人注目的里程碑。截至2024年1月，已有6款siRNA藥物上市。通過對這6款已上市siRNA藥物臨床前安評總結(jié)分析，可以為此類藥物臨床前毒理設(shè)計提供參考。相信將來會有更多的siRNA藥物上市，而相關(guān)的臨床前指導(dǎo)原則也將隨之逐漸完善和發(fā)布。
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