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前言

 

遺傳毒性(genotoxcity)是指遺傳物質(zhì)中任何有害變化引起的毒性，而不考慮誘發(fā)該變化的機制，又稱為基因毒性。遺傳（基因）毒性雜質(zhì)是指能引起遺傳毒性的雜質(zhì)，包括致突變性雜質(zhì)和其他類型的無致突變性雜質(zhì)。

遺傳（基因）毒性雜質(zhì)主要來源于原料藥或制劑的生產(chǎn)過程，如起始原料、反應物、催化劑、試劑、溶劑、中間體、副產(chǎn)物、降解產(chǎn)物等。致突變性雜質(zhì)(mutagenic impurities)指在較低水平時也有可能直接引起DNA損傷，導致DNA突變，從而可能引發(fā)癌癥的遺傳毒性雜質(zhì)。

基因毒性雜質(zhì)的研究和控制對質(zhì)量研究工作者來說一直是具有挑戰(zhàn)性的，近些年來CDE關于基毒雜質(zhì)研究的發(fā)補案例也不在少數(shù)。

 

本文宗旨

 

相信很多小伙伴也看過不少相關的法規(guī)和文章了，但是面對基因毒性雜質(zhì)時，是不是往往會出現(xiàn)下面的問題和困惑：

 

● 毒性數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)址保存了不少，但是仍不知如何運用，檢索沒有條理；

 

● 部分化合物找不到相關的毒理學數(shù)據(jù)時，無法確定是否具有基因毒性，研發(fā)早期（工藝摸索階段），沒有做(Q)SAR預測時，不知是否需要將該雜質(zhì)當作基因毒性雜質(zhì)控制；

 

● 基因毒性雜質(zhì)限度計算的公式不止一個，不同計算方式之間到底有什么區(qū)別，哪種計算方式更合理；

 

● 基因毒性雜質(zhì)如何科學地制定控制策略，是否定入質(zhì)量標準？怎樣既能滿足申報，又能減少檢測成本；

 

為了幫助大家解決以上的問題，筆者為大家梳理了基因毒性雜質(zhì)評估的流程，雜質(zhì)限度計算的方式，以及控制策略。

 

1、 基因毒性雜質(zhì)評估-定性

 

基因毒性雜質(zhì)的定性評估包括以下4個步驟：

 

● Step1-“根據(jù)警示結構，確定潛在致突變雜質(zhì)”：即根據(jù)工藝情況，結合警示結構篩選出潛在的致突變雜質(zhì)。常見的警示結構包括：環(huán)氧類、亞硝胺類、磺酸酯、鹵代烴、肼、芳香胺、硝基化合物、氨基化合物等。

 

● Step2-“數(shù)據(jù)庫+文獻檢索”：通過數(shù)據(jù)庫檢索或者查找文獻，獲取化合物的致癌性、致突變性數(shù)據(jù)，若有充分的數(shù)據(jù)支持，則可直接借助文獻得出定性結論。

常用的基因毒性雜質(zhì)的定性檢索數(shù)據(jù)庫包括如下：

 

網(wǎng)站名	網(wǎng)址鏈接	定性類別
日本厚生	https://anzeninfo.mhlw.go.jp/user/anzen/kag/sokatutbl.htm	致突變評估
NTP	https://manticore.niehs.nih.gov/cebssearch	致突變評估
OECD	https://hpvchemicals.oecd.org/UI/Search.aspx	致突變+致癌評估
EPA	https://comptox.epa.gov/dashboard/	致突變+致癌評估
CPBD	https://files.toxplanet.com/cpdb/cpdb.html	致癌評估（含TD50）

 

筆者在前文也提到過，部分化合物查詢不到相關的數(shù)據(jù)（致癌性和致突變性都查不到），必須借助商業(yè)化軟件預測，但是在研發(fā)早期（工藝摸索階段），工藝路線沒有確定，此階段的基因毒性雜質(zhì)評估不是必做不可，因此部分企業(yè)出于成本考慮，一般不會做(Q)SAR預測，這就勢必導致部分化合物無法確定是否納入基因毒性雜質(zhì)考慮。但是研發(fā)早期（工藝摸索階段），如若能夠進行風險預判，對于工藝路線的篩選也是有利的。

 

那么有沒有一種辦法可以幫助質(zhì)量研究工作者進行基因毒性雜質(zhì)的風險預判呢？筆者為大家整理了400+個化合物的Ames和染色體畸變數(shù)據(jù)（文末有領取方式），可以直接對雜質(zhì)進行致突變評估，而沒有查詢到的化合物，也可通過該數(shù)據(jù)庫中的結構類似化合物進行風險預判。

 

以氯乙醛為例，在該數(shù)據(jù)庫中查到染色體畸變?yōu)镻ositive，故氯乙醛定為基毒雜質(zhì)，并且可在該數(shù)據(jù)庫中直接獲取檢測的pdf報告的網(wǎng)址。

 

 

以三氯乙酸為例，未能查詢到該雜質(zhì)的基毒數(shù)據(jù)，但查詢到相關化合物氯乙酸和二氯乙酸的數(shù)據(jù)如下，存在Positive的檢測結果。因此在沒有進行商業(yè)化正規(guī)軟件預測前，應先將三氯乙酸視為關注的潛在基因毒性雜質(zhì)，即：風險嚴控。

 

● Step3-“軟件預測”： 依據(jù)step2的數(shù)據(jù)庫檢索，如若沒有充分的數(shù)據(jù)用于定性，則應當使用商業(yè)化軟件預測，根據(jù)ICH M7的要求，應采用兩個相補的(Q)SAR 預測方法。一個方法應基于專家規(guī)則，另一個方法應基于統(tǒng)計學。

 

● Step4-“遺傳毒性試驗”：根據(jù)CDE公布的《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》，推薦兩種標準試驗組合，如下：

 

組合一：（1）一項細菌回復突變試驗；（2）一項檢測染色體損傷的體外細胞遺傳學試驗（體外中 期相染色體畸變試驗或體外微核試驗），或一項體外小鼠淋巴瘤 細胞 Tk 基因突變試驗；（3）一項體內(nèi)遺傳毒性試驗，通常為嚙齒類動物造血細胞 染色體損傷試驗，用于檢測微核或中期相細胞染色體畸變。

 

組合二：（1）一項細菌回復突變試驗；（2）采用兩種不同組織進行的體內(nèi)遺傳毒性試驗，通常為 一項嚙齒類動物造血細胞微核試驗和第二項體內(nèi)試驗。

備注：感興趣的小伙伴可以直接在CDE官網(wǎng)上搜索《藥物遺傳毒性研究技術指導原則》進一步學習。

 

2 、基因毒性雜質(zhì)的分類和限度計算-定量

 

通過本文01項下的定性數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)庫和文獻檢索致癌性和細菌致突變性數(shù)據(jù)，(Q)SAR評估以及遺傳毒性試驗等），按照表1（源自ICH M7）將其歸為類，不同類別的基因毒性雜質(zhì)對應不同的限度計算方式。

 

對于1類基因毒性雜質(zhì)：通?？刹樵兊絇DE值或TD50值，亦或者是毒理學閾值，可通過這三種方式計算限度。計算的優(yōu)先順序通常為：PDE法＞TD50線性外推法＞毒理學閾值。

 

（1）計算方式1（PDE法）：

 

限度=PDE/最大日劑量

 

（2）計算方式2（TD50線性外推法）：即通過嚙齒類動物致癌性數(shù)據(jù)來計算雜質(zhì)的可接受攝入量。如采用TD50值的1/50000作為攝入量，即相當于終生潛在發(fā)生腫瘤的風險為十萬分之一。

 

限度=TD50/50 000×50kg/最大日劑量

 

（3）計算方式3（基于毒理學閾值）：此類雜質(zhì)可通過未觀察到作用劑量(no-observed effect level，NOEL)或者觀察到作用的最低水平(lowest-observed effect level，LOEL)和釆用不確定性因子來計算每日允許暴露量(permitted daily exposure，PDE），再根據(jù)計算方式1計算雜質(zhì)限度。

 

 

式中 體重以50kg計；

F1為從不同物種外推到人的因子；

F2為個體差異因子；

F3為根據(jù)毒性暴露周期釆用的可變因子；

F4為根據(jù)毒性嚴重情況采用的可變因子；

F5采用NOEL時一般為1，采用LOEL時應根據(jù)毒性的嚴重程度確定，最高可為10。

這個時候，小伙伴們是不是又有疑問了，PDE、TD50、NOEL這些數(shù)據(jù)去哪里查呢？筆者常用的一些數(shù)據(jù)庫網(wǎng)址如下：

 

對于2類基因毒性雜質(zhì)：根據(jù)毒理學關注閾值(threshold of toxicological concern，TTC)計算可接受攝入量，可根據(jù)給藥周期調(diào)整日攝入量。

 

限度=TTC/最大日劑量

 

 

備注：此表源于9306 遺傳毒性雜質(zhì)控制指導原則

 

對于3類基因毒性雜質(zhì)：根據(jù)軟件評估結果或Ames試驗，納入2類或5類控制，限度計算分別參考各分類項下描述。

 

對于4、5類雜質(zhì)：按一般雜質(zhì)控制。

 

3、 基因毒性雜質(zhì)的控制策略

 

基因毒性雜質(zhì)如何科學地制定控制策略，既能滿足申報，又能減少檢測成本？ICH M7中描述了4種控制策略，實際工作中都是非常常用的，不同品種看情況可以靈活使用。

 

策略1---定入質(zhì)量標準，周期性檢測

在連續(xù)6次中試批次或者3個連續(xù)的生產(chǎn)批次中，致突變雜質(zhì)均低于可接受限度的30%，則不納入常規(guī)檢測中，但需進行周期性檢測。

 

策略2---定入中間體質(zhì)量標準

在成品中無有效方法控制，可定入中間體，限度與成品保持一致。

 

策略3---制定一個高于成品的限度（限度放寬），控制點向上游動

使用合適的分析方法，結合雜質(zhì)的去向和清除實驗（Spiking），且多批次中試終產(chǎn)品中雜質(zhì)均低于限度30%，則可在上游工藝中采用高限度控制策略，且在后續(xù)工藝中無需再進行檢測。

 

策略4---不定入任何質(zhì)量標準

明確工藝參數(shù)與殘留雜質(zhì)水平的關系，任何的工藝變動，雜質(zhì)均未超過限度的30%，則可不定入質(zhì)量標準。（尤其適用于極不穩(wěn)定的雜質(zhì)，如酰氯類）

 

主要參考文獻：

 

【1】《中國藥典》2020版，9306

【2】ICH M7