前言
有水就有生命，有水就有生化反應(yīng)，水也是引起產(chǎn)品降解從而導(dǎo)致保質(zhì)期縮短的主要因素之一；
冷凍干燥是一個(gè)在很低的溫度下通過(guò)升華和解吸附的方式去除產(chǎn)品中水分的過(guò)程；
殘余水分和頂空殘氧量是兩個(gè)促進(jìn)產(chǎn)品降解的常見(jiàn)因素，會(huì)引起產(chǎn)品的穩(wěn)定性變化從而導(dǎo)致產(chǎn)品保質(zhì)期不足；
冷凍干燥可以很好的同時(shí)解決這兩個(gè)問(wèn)題；
藥物分子在凍干狀態(tài)下保持穩(wěn)定的機(jī)理是：形成了具有低分子流動(dòng)性和低反應(yīng)活性的高粘度無(wú)定形玻璃態(tài)；
玻璃態(tài)/無(wú)定形態(tài)的臨界點(diǎn)是玻璃轉(zhuǎn)化溫度（Tg）：將凍干產(chǎn)品暴露在高于其玻璃轉(zhuǎn)化溫度（Tg）的溫度下，粘稠的玻璃態(tài)將轉(zhuǎn)化為粘稠度較低的 "橡膠 "態(tài)（如圖一），其熱容量、分子流動(dòng)性和反應(yīng)性都會(huì)增加，從而穩(wěn)定性降低；
圖一：Tg、粘度、溫度之間的關(guān)系圖
凍干產(chǎn)品的溫度超過(guò) Tg 值還會(huì)有反玻璃化的風(fēng)險(xiǎn)：即某些可結(jié)晶的輔料會(huì)發(fā)生結(jié)晶，從而進(jìn)一步影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性；
凍干產(chǎn)品的 Tg 值的確定對(duì)設(shè)計(jì)加速穩(wěn)定性研究非常重要。因?yàn)樵诟哂?Tg 值的溫度下生成的加速穩(wěn)定性數(shù)據(jù)無(wú)法預(yù)測(cè)在較低儲(chǔ)存溫度下產(chǎn)品的行為，也不能由此來(lái)估計(jì)產(chǎn)品的保質(zhì)期；
建議在至少低于產(chǎn)品Tg 10℃的條件下，進(jìn)行產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究。
* Chang 等人報(bào)告說(shuō)，當(dāng) IL-2 的儲(chǔ)存溫度高于其 Tg 值時(shí)，其脫氨率和聚集率更高；
Strickley等人報(bào)道，隨著儲(chǔ)存溫度的升高：接近或超過(guò)Tg值時(shí)，胰島素的聚集速率會(huì)增加，即使在玻璃狀態(tài)下也會(huì)發(fā)生脫酰胺；
其他研究小組報(bào)告顯示，Tg對(duì)酶活性的穩(wěn)定性沒(méi)有太大影響。
凍干粉餅的水分含量和Tg又有什么關(guān)系呢？
凍干粉餅的Tg隨著其水分含量的升高而降低：大概水分每增加1%，則產(chǎn)品的Tg降低10℃（此數(shù)據(jù)僅為一個(gè)大概的數(shù)據(jù)，用戶幫助大家理解Tg和粉餅水分之間的關(guān)系）
圖二紅色框內(nèi)部分也表達(dá)了兩者之間的關(guān)系：
圖二：冷凍干燥過(guò)程中的相圖
為了提高產(chǎn)品存儲(chǔ)的穩(wěn)定性，需要將凍干后產(chǎn)品的水分降到一個(gè)很低的數(shù)值；
對(duì)于每個(gè)產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，降低到多低的數(shù)值：小于＜2%、1%，還是3%？根據(jù)產(chǎn)品分子的不同，這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)都會(huì)不同；
很多同學(xué)私信問(wèn)我：凍干產(chǎn)品是否有一個(gè)統(tǒng)一的水分標(biāo)準(zhǔn)，是否是越低越好，還有同學(xué)說(shuō)他們產(chǎn)品水分必須要達(dá)到0.5%以下才能保持穩(wěn)定性如何才能做到？
但很遺憾，這些問(wèn)題都沒(méi)有辦法用一句話來(lái)回答，并不存在統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)答案；
對(duì)于每一種凍干產(chǎn)品：都需要通過(guò)系統(tǒng)的水分研究來(lái)評(píng)估殘余水分含量對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量屬性的影響。這項(xiàng)研究的結(jié)果將為產(chǎn)品殘余水分標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)計(jì)提供依據(jù)。
有兩種方法可以用于研究?jī)龈僧a(chǎn)品的最終水分標(biāo)準(zhǔn)，本篇文章將會(huì)詳細(xì)介紹這兩種研究方法。
方法 一：水分吸附等溫線
為配方/產(chǎn)品最初建立的吸濕等溫線如圖 3 所示；
水分吸附等溫線將水活性（αw）與相應(yīng)的凍干材料聯(lián)系起來(lái)，每種材料和溫度對(duì)應(yīng)的等溫線都是唯一的；
圖三：25 °C 時(shí)蛋白質(zhì)配方的吸附等溫線
吸濕等溫線通常使用吸附微天平以重力法獲得；
要獲得吸濕等溫線，需要將初始干燥的樣品置于相對(duì)濕度（RH）不斷增加的環(huán)境中，通常最高可達(dá) 70% RH；
在每個(gè)水活度水平上，連續(xù)測(cè)量樣品的重量，直到觀察到平衡為止。
理論上，當(dāng)樣品的重量隨時(shí)間保持不變時(shí)，平衡就建立了。不過(guò)，在實(shí)踐中，當(dāng)樣品重量在預(yù)定時(shí)間內(nèi)的變化足夠小時(shí)，就可以認(rèn)為樣品處于平衡狀態(tài)。
在較高的相對(duì)濕度下，配方中的某些成分/輔料可能會(huì)結(jié)晶，這一點(diǎn)可從水分的解吸中看出來(lái)；
某些輔料的結(jié)晶可通過(guò)偏光顯微鏡來(lái)確定，如圖 4 所示，回收的樣品會(huì)出現(xiàn)雙折射；
通過(guò)粉末X射線衍射可以確認(rèn)結(jié)晶。
圖四：偏光顯微鏡觀察從吸附微天平上回收的樣品，顯示某些配方成分結(jié)晶 成分結(jié)晶可通過(guò)粉末 X 射線 衍射
水分平衡
一旦建立了吸附等溫線，就可以通過(guò)兩種方法來(lái)研究在不影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的情況下，產(chǎn)品中可以殘留的最大水分含量；
一種方法是在不同的相對(duì)濕度下平衡凍干的蛋糕，以獲得不同水平的殘余水分含量；
不同的相對(duì)濕度可通過(guò)不同濃度的 NaOH 溶液（見(jiàn)表一）來(lái)實(shí)現(xiàn)；
|
NaOH 溶液測(cè)得 |
R.H (%) |
預(yù)期含水量 |
測(cè)量的含水量 |
|
水分含量（%） |
|
（%） |
|
|
（%） |
|
|
濃度（摩爾） |
_ |
_ |
干燥 |
卡爾費(fèi)休滴定法 |
|
|
|
失重法 |
|
23.05 |
11 |
13 |
1.7 |
1.7 |
|
14.96 |
25 |
2.4 |
3,1 |
2,8 |
|
12.53 |
35 |
3.2 |
3.8 |
3.5 |
|
10.64 |
45 |
4.3 |
4.9 |
4.8 |
表一：氫氧化鈉鹽濃度可實(shí)現(xiàn)不同的濕度
或使用不同鹽類的飽和溶液來(lái)提供不同的相對(duì)濕度，如表二 所示；
|
鹽溶液 |
Control |
LiCI |
LiI |
MgCI2 |
Mg(NO3)2 |
|
% 相對(duì)濕度 (RH) |
N/A |
11 |
18 |
33 |
53 |
|
% 西林瓶中樣品水分 |
0.6 |
1.2 |
1.6 |
2,7 |
4.2 |
表二：環(huán)境相對(duì)濕度VS樣品水分
樣品在這些溶液中在真空條件下平衡一夜， 過(guò)夜平衡后的樣品含水是用干燥失重法法和卡爾費(fèi)休滴定法測(cè)量，結(jié)果見(jiàn)表一。
這些不同的殘余含水量的樣品在加速（37 °C）條件下放置3 個(gè)月；
在建議的儲(chǔ)存條件下（2°C 至 8°C）放置 2-3 年；
根據(jù)這些數(shù)據(jù)，確定凍干產(chǎn)品的最終殘余水份指標(biāo)，并在最終產(chǎn)品的放行實(shí)驗(yàn)中執(zhí)行；
樣品準(zhǔn)備
? 將裝有飽和鹽溶液的培養(yǎng)皿連同濕度計(jì)一起放入干燥器或手套箱中，讓其過(guò)夜平衡；
? 如果使用手套/干燥箱，則用氮?dú)獯祾吒稍锵?，直到相?duì)濕度低于鹽溶液的預(yù)期水平；
? 將西林瓶放入干燥箱或手套箱中，在箱內(nèi)或干燥箱中打開(kāi)膠塞并關(guān)閉干燥箱門；
? 在 t = 0、t = 24 小時(shí)和 t = 48 小時(shí)時(shí)取出樣品瓶，用卡爾費(fèi)休法測(cè)定水分含量。
卡爾費(fèi)休水分分析法
表 二 和圖 五 總結(jié)了卡爾費(fèi)休法測(cè)量的暴露于不同相對(duì)濕度百分比后的含水量；
圖 五 平均殘余水分值與相對(duì)濕度百分比的關(guān)系
方法 二：凍干機(jī)在線取樣法
在凍干工藝運(yùn)行過(guò)程中，不斷地取出樣品；
在這種方法中，當(dāng)一次干燥達(dá)到終點(diǎn)的時(shí)候（當(dāng)皮拉尼壓力計(jì)與電容壓力計(jì)（CM）的壓力趨于一致時(shí)），從不同位置用凍干機(jī)配備的在線取樣裝置取出西林瓶；
圖六：在線取樣時(shí)間段標(biāo)示圖
一次干燥到二次干燥升溫的斜坡階段，二次干燥溫度保持階段每隔1-3小時(shí)，用在線取樣裝置從凍干機(jī)中取出西林瓶并在取樣之后壓塞；
圖七：凍干機(jī)上在線取樣裝置工作示意圖
圖八：取樣后進(jìn)行壓蓋示意圖
圖九：在線取樣裝置實(shí)物圖
一次干燥結(jié)束后，一次干燥到二次干燥的升溫階段，二次干燥的溫度保持階段，樣品中的殘余水分不斷減少，如圖十：
圖十：在線取樣樣品水分變化示意圖
（初始水分根據(jù)產(chǎn)品的不同而不同，我示范的這個(gè)數(shù)據(jù)初始水分偏低不少）
不同時(shí)間段取出的樣品，殘余水份也都不同；
這些不同的殘余含水量的樣品在加速（37 °C）條件下放置3 個(gè)月；
在建議的儲(chǔ)存條件下（2°C 至 8°C）放置 2-3 年；
根據(jù)這些數(shù)據(jù)，確定凍干產(chǎn)品的最終殘余水份指標(biāo)，并在最終產(chǎn)品的放行實(shí)驗(yàn)中執(zhí)行；
注釋：
產(chǎn)品裝量規(guī)格
? 在選擇西林瓶膠塞和最終產(chǎn)品的裝量規(guī)格時(shí)必須謹(jǐn)慎；
? 需要注意當(dāng)裝量減小或西林瓶和瓶塞尺寸增大時(shí)，在 2 年保質(zhì)期內(nèi)有可能出現(xiàn)凍干粉餅水份超標(biāo)的情況；
? 西林瓶和膠塞的尺寸增大時(shí)，在 2 年保質(zhì)期內(nèi)殘余水份超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)就會(huì)大大增加；
? 當(dāng)粉餅質(zhì)量減少時(shí)，殘余水份超過(guò)在2年保質(zhì)期內(nèi)超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)大大增加如表三；
|
特征 |
產(chǎn)品A |
產(chǎn)品B |
|
產(chǎn)品水分限度 |
2% |
|
蛋糕重量 |
500mg |
50mg |
|
膠塞重量 |
2.5gm |
|
膠塞水分 |
0.2% = 5 mg |
|
潛在產(chǎn)品水分 |
1% |
10% |
表三 減少灌裝干物質(zhì)質(zhì)量導(dǎo)致水分指標(biāo)不合格的風(fēng)險(xiǎn)說(shuō)明
*膠塞水分遷移是影響產(chǎn)品水分的一個(gè)重要因素，此篇主要講凍干產(chǎn)品水分指標(biāo)的確定方法，膠塞水分遷移的原理和解決方案以后再單獨(dú)開(kāi)一篇來(lái)講吧。
最后的話
凍干產(chǎn)品的最終水分沒(méi)有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)；
每個(gè)產(chǎn)品用一套確定水分標(biāo)準(zhǔn)的研究方法來(lái)確定一個(gè)這個(gè)產(chǎn)品需要符合的水分放行標(biāo)準(zhǔn)；
在實(shí)踐中，我們看見(jiàn)有些產(chǎn)品的水分合格標(biāo)準(zhǔn)是低于2%、有些是低于1%，有些將3%作為放行標(biāo)準(zhǔn)也完全沒(méi)問(wèn)題。關(guān)鍵是你對(duì)于這個(gè)問(wèn)題進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)的研究，有足夠的數(shù)據(jù)作為支持；
實(shí)踐中大家的水分標(biāo)準(zhǔn)常常是從同類產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)“借鑒“來(lái)的，有些同學(xué)因?yàn)檫@個(gè)問(wèn)題收到了來(lái)自監(jiān)管部門的“挑戰(zhàn)”；
如果在制定標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)程中，遵循科學(xué)的方法，積累了足夠的數(shù)據(jù)，這個(gè)“挑戰(zhàn)”可能更可以是一個(gè)證明我們研究過(guò)程嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?ldquo;機(jī)會(huì)”；
參考文獻(xiàn)：
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