摘 要：為了保證化學(xué)藥品注射劑的安全性，需加強(qiáng)對(duì)所用直接接觸藥品包材的熱原的有效控制。通過對(duì)國(guó)內(nèi)外相關(guān)法規(guī)及指南的匯總比較，結(jié)合審評(píng)工作實(shí)踐，對(duì)包材除熱原常用工藝及相關(guān)驗(yàn)證要求進(jìn)行探討。企業(yè)應(yīng)基于包材類型及材料的性質(zhì)，對(duì)除熱原工藝進(jìn)行研究和驗(yàn)證，證明其去除熱原的能力滿足要求。常見的玻璃包材除熱原工藝為干熱處理，常見的膠塞除熱原工藝為沖洗除熱原，塑料包材通常通過粒料內(nèi)毒素控制、高溫吹塑工藝及生產(chǎn)環(huán)境來保障細(xì)菌內(nèi)毒素符合要求。在除熱原驗(yàn)證中，應(yīng)合理選擇內(nèi)毒素指示劑并制訂除熱原驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)通常為內(nèi)毒素至少下降3個(gè)對(duì)數(shù)單位。
熱原系指注射后能引起人體體溫異常升高的致熱物質(zhì)［1］。含有熱原的注射劑進(jìn)入人體，會(huì)使人體出現(xiàn)發(fā)冷、寒戰(zhàn)、體溫升高、身痛、出汗、惡心嘔吐等不良反應(yīng)；有時(shí)體溫可升至40 ℃，嚴(yán)重者出現(xiàn)昏迷、虛脫，甚至有生命危險(xiǎn)［2］。注射劑中熱原引入的途徑包括注射用水，原輔料，生產(chǎn)過程中所用容器、用具、管道和裝置，制備過程和生產(chǎn)環(huán)境，輸液器具等。
為了保障藥品安全性，在《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010 年修訂）》附錄 1“無(wú)菌藥品第 3 條”中明確指出“無(wú)菌藥品的生產(chǎn)須滿足其質(zhì)量和預(yù)定用途的要求，應(yīng)當(dāng)最大限度降低微生物、各種微粒和熱原的污染”［3］。隨著注射劑一致性評(píng)價(jià)工作的啟動(dòng)和開展，2020 年 5 月國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心發(fā)布了《化學(xué)藥品注射劑仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)技術(shù)要求》［4］，其中提到為了有效控制熱原（細(xì)菌內(nèi)毒素），需加強(qiáng)對(duì)原輔料、生產(chǎn)過程等的控制，并且該技術(shù)要求明確提出應(yīng)提交直接接觸藥品的內(nèi)包材的除熱原驗(yàn)證或供應(yīng)商出具的相關(guān)證明資料。
直接接觸藥品的內(nèi)包材，是化學(xué)藥品注射劑的組成部分之一，是由1種或多種材料制成的包裝組件組合而成，應(yīng)具有良好的安全性、適應(yīng)性、穩(wěn)定性、功能性、保護(hù)性和便利性，在藥品的包裝、貯藏、運(yùn)輸和使用過程中起到保護(hù)藥品質(zhì)量、安全、有效、實(shí)現(xiàn)給藥目的的作用［5］。本文通過對(duì)美國(guó)、歐洲以及國(guó)內(nèi)相關(guān)法規(guī)及指南的匯總比較，結(jié)合審評(píng)工作實(shí)踐，對(duì)包材除熱原常用的工藝及相關(guān)驗(yàn)證要求進(jìn)行探討，除熱原所用的工藝主要取決于容器類型和密封件材料的性質(zhì)，企業(yè)應(yīng)對(duì)除熱原工藝進(jìn)行研究和驗(yàn)證，證明其去除熱原的能力滿足要求。希望能夠助力于企業(yè)實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)品熱原水平的有效控制，保障注射劑安全性。
1、 直接接觸藥品內(nèi)包材除熱原工藝的要求
注射劑直接接觸藥品的內(nèi)包材按材質(zhì)分類可分為玻璃類、橡膠類、塑料類和其他類等，可以由 2種或2種以上的材料復(fù)合或組合而成。常用的玻璃類藥包材有中硼硅管制注射劑瓶、中硼硅玻璃安瓿、鈉鈣玻璃輸液瓶等；常用的橡膠類藥包材有注射液用鹵化（氯化、溴化）丁基橡膠塞、注射用冷凍干燥用鹵化（氯化、溴化）丁基橡膠塞等；常用的塑料類藥包材有聚丙烯輸液瓶、聚丙烯直立式軟袋、聚乙烯安瓿等［5］。
對(duì)于直接接觸藥品的內(nèi)包材來說，除熱原所用的工藝主要取決于容器類型和密封件材料的性質(zhì)，如玻璃器材和其他耐熱材料最常見的除熱原工藝是干熱處理，熱不穩(wěn)定材料常用除熱原工藝是清洗處理。
1.1 玻璃類內(nèi)包材除熱原
在化學(xué)藥品注射劑的生產(chǎn)中，玻璃容器一般通過輸送機(jī)械進(jìn)行自動(dòng)流轉(zhuǎn)，采用一體化的清洗設(shè)備和隧道烘箱，對(duì)容器進(jìn)行清洗和除熱原。清洗玻璃容器通常是洗灌封聯(lián)動(dòng)生產(chǎn)線上的第 1 步，清洗過程能有效去除微粒、化學(xué)污染物以及熱原。清洗程序一般包括：玻璃容器裝水后浸入水浴，通過超聲對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行機(jī)械分離；純化水或注射用水通過噴嘴噴淋容器內(nèi)表面和外表面；用注射用水噴淋至少 1次；通入無(wú)菌過濾的壓縮空氣將容器吹干；轉(zhuǎn)運(yùn)至隧道烘箱滅菌干燥。其中沖淋速度和工藝循環(huán)次數(shù)是清洗的關(guān)鍵工藝參數(shù)。清洗后重點(diǎn)關(guān)注洗滌后玻璃容器的可見異物、不溶性微粒。通過細(xì)菌內(nèi)毒素挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證清洗程序?qū)Τ裏嵩挠行浴?/span>
玻璃包材的干熱滅菌通常是洗灌封聯(lián)動(dòng)生產(chǎn)線上的第2步，最常見的干熱滅菌設(shè)備為隧道烘箱，對(duì)玻璃包材進(jìn)行除熱原和干燥。最典型的干熱除熱原工藝條件是將材料放在250 ℃條件下至少30 min。匯總《歐洲藥典》《美國(guó)藥典》《中國(guó)藥典》關(guān)于干熱除熱原條件的描述 ，具體如下 ：（1）《歐洲藥典》11.2“5.1.2 注射劑生產(chǎn)中所用材料除熱原”章節(jié)中寫道“常見的干熱除熱原循環(huán)包括將材料放在溫度250 ℃條件下至少30min，亦可使用與其他溫度（高于170℃）和時(shí)長(zhǎng)組合”［6］；“2.6.14 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”章節(jié)中寫道“使用經(jīng)過驗(yàn)證的工藝，在熱風(fēng)烘箱中對(duì)所有玻璃器皿和其他熱穩(wěn)定性設(shè)備進(jìn)行除熱原 處 理 。通 常 使 用 的 最 低 溫 度 和 最 短 時(shí) 間 為250℃、30min”［7］。（2）《美國(guó)藥典》2023年版“85 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”章節(jié)中寫道“使用經(jīng)過驗(yàn)證的工藝，在熱風(fēng)烘箱中對(duì)所有玻璃器皿和其他熱穩(wěn)定性設(shè)備進(jìn)行除熱原處理。通常使用的最低溫度和最短時(shí)間為250 ℃、30 min”［8］。（3）《中國(guó)藥典》2020年版“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”章節(jié)中寫道“試驗(yàn)所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250℃、30min以上）去除，也可采用其他確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法”［9］。
1.2 橡膠類內(nèi)包材除熱原
藥品包裝常用的橡膠材料主要有：聚異戊二烯橡膠、丁基橡膠、鹵化（氯化、溴化）丁基橡膠、硅橡膠、三元乙丙橡膠等?；瘜W(xué)藥品注射劑最常用的橡膠類內(nèi)包材為鹵化丁基橡膠塞。根據(jù)潔凈度鹵化丁基膠塞通常分為4類：需洗滌的膠塞、需漂洗的膠塞、免洗膠塞（RFS）和即用膠塞（RFU）［10］。
1.2.1 需洗滌的膠塞
在使用前需要藥品生產(chǎn)企業(yè)開展的處理工序較多，包括清洗和硅化等操作。此類膠塞含有較多雜質(zhì)，如顆粒、纖維、微生物、熱原等。在清洗時(shí)需要使用清洗劑和大量清洗用水。此類膠塞目前國(guó)內(nèi)外均較少使用。
1.2.2 需漂洗的膠塞
膠塞生產(chǎn)企業(yè)已經(jīng)對(duì)膠塞進(jìn)行了清洗和初步滅菌，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中訂入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)，并完成了細(xì)菌內(nèi)毒素的出廠檢驗(yàn)。藥品生產(chǎn)企業(yè)用適量熱注射用水漂洗，再進(jìn)行烘干滅菌即可使用。
1.2.3 RFS
又稱待滅菌膠塞或免洗膠塞，膠塞生產(chǎn)企業(yè)對(duì)膠塞進(jìn)行了預(yù)潤(rùn)滑，且有效去除了細(xì)菌內(nèi)毒素、微粒，藥品生產(chǎn)企業(yè)拆開膠塞包裝后只需進(jìn)行滅菌操作即可使用。此類膠塞由膠塞生產(chǎn)企業(yè)對(duì)熱原、微生物進(jìn)行控制、檢驗(yàn)，并對(duì)除熱原方法進(jìn)行驗(yàn)證。
1.2.4 RFU
此類膠塞是在滿足RFS 膠塞的全部要求的基礎(chǔ)上，膠塞生產(chǎn)企業(yè)完成了滅菌處理，并確保膠塞處于無(wú)菌狀態(tài)。藥品生產(chǎn)企業(yè)拆開包裝即可使用。
對(duì)于需要洗滌或漂洗的膠塞，一般采用洗塞機(jī)進(jìn)行清洗。清洗程序需要根據(jù)膠塞的種類（凍干膠塞、小容量注射劑膠塞、輸液膠塞等）和數(shù)量來研究和確定，該程序需要進(jìn)行驗(yàn)證。膠塞清洗機(jī)采用水力沖洗或者機(jī)械攪動(dòng)的方式清除膠塞上粘附的微粒物質(zhì)，并且避免微粒在其他膠塞上再次沉積。洗滌過程應(yīng)使用純化水進(jìn)行初始沖洗，使用熱注射用水進(jìn)行最終沖洗。再對(duì)清洗過后的膠塞進(jìn)行滅菌和干燥。通常經(jīng)多次熱的注射用水沖洗后能夠去除熱原。各個(gè)步驟的時(shí)間間隔應(yīng)進(jìn)行規(guī)定，不宜過長(zhǎng)。避免過程中由于膠塞上的殘留水導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)和內(nèi)毒素的再次生成。在最短時(shí)間內(nèi)，在高效過濾器過濾過的空氣中完成膠塞的滅菌和干燥。
1.3 塑料類內(nèi)包材除熱原
藥用塑料容器一般是由熱塑性塑料粒料或材料成型加工而成的中空容器，成型工藝包括擠出吹塑成型、注射注吹、注拉吹成型、多層共擠吹塑成型等。藥用塑料材料和容器單獨(dú)或與其他材料組合成包裝系統(tǒng)后可用于包裝所適用的藥品。也可以采用吹灌封（BFS）工藝直接生產(chǎn)藥品［11］。
塑料包材通常通過粒料的內(nèi)毒素控制、高溫吹塑工藝，以及在符合生產(chǎn)潔凈廠房標(biāo)準(zhǔn)要求的環(huán)境中生產(chǎn)和組裝，來保證其細(xì)菌內(nèi)毒素滿足相關(guān)國(guó)家藥包材標(biāo)準(zhǔn)［12］中的控制要求。
2、 直接接觸藥品內(nèi)包材除熱原驗(yàn)證的要求
2.1 除熱原驗(yàn)證的總體要求
一般通過在確定的最難除熱原的位置添加合適的內(nèi)毒素指示劑來進(jìn)行驗(yàn)證除熱原工藝的有效性。采用清洗方式除熱原時(shí)，可根據(jù)包材特性評(píng)估其最難清洗的位置（如膠塞與藥品接觸的部分），并涂抹內(nèi)毒素指示劑。采用干熱滅菌除熱原時(shí)可通過熱分布和熱穿透研究，確定設(shè)備中最難加熱位置，并在該位置添加內(nèi)毒素指示劑。
部分包材的除熱原操作由包材生產(chǎn)企業(yè)完成，如 RFS和 RFU，藥品生產(chǎn)企業(yè)不需再進(jìn)行清洗和除熱原，但是仍有責(zé)任保證內(nèi)包材的質(zhì)量符合要求。如果藥品生產(chǎn)企業(yè)不對(duì)每批內(nèi)包材進(jìn)行熱原、內(nèi)毒素檢測(cè)，應(yīng)當(dāng)復(fù)核和評(píng)估供應(yīng)商驗(yàn)證方案和最終驗(yàn)證報(bào)告，并定期檢測(cè)確立供應(yīng)商檢測(cè)結(jié)果的可靠性，并提供相關(guān)證明性文件。
2.2 內(nèi)毒素指示劑
內(nèi)毒素指示劑由純化的細(xì)菌內(nèi)毒素（脂多糖）組成。使用者應(yīng)明確以下信息：生產(chǎn)商名稱、指示劑的成分、內(nèi)毒素來源微生物種屬、內(nèi)毒素的活性單位、存貯條件和有效期、批號(hào)等信息。細(xì)菌內(nèi)毒素挑戰(zhàn)試驗(yàn)所用的細(xì)菌內(nèi)毒素一般為大腸埃希菌Escherichia coli內(nèi)毒素。
根據(jù)除熱原的材料屬性不同（如玻璃、橡膠、塑料），在除熱原工藝驗(yàn)證中使用適當(dāng)?shù)膬?nèi)毒素指示劑。常見的內(nèi)毒素指示劑分為即買即用型內(nèi)毒素指示劑和內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
即買即用型內(nèi)毒素指示劑以安瓿瓶、西林瓶或其他包材作為載體，接種了已知數(shù)量的內(nèi)毒素，可用于測(cè)量?jī)?nèi)毒素減少量。材料不同可能除熱原工藝的效果亦不同，因此所用載體類型必須能代表除熱原的材料。內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液可直接接種在材料表面，在干燥之后，將接種的材料用于測(cè)量除熱原工藝中內(nèi)毒素減少量。建議關(guān)注涂布內(nèi)毒素溶液的效價(jià)、稀釋溶液體積和干燥方式。內(nèi)毒素與接觸的材料表面存在吸附或結(jié)合作用，內(nèi)毒素溶液的效價(jià)通常應(yīng)大于 1 000 EU［1 EU 與 1個(gè)內(nèi)毒素國(guó)際單位（IU）相當(dāng)］，體積應(yīng)≤0.1 mL，以減少干燥時(shí)間并有助于固定［13］。
在除熱原工藝前后均應(yīng)使用經(jīng)過驗(yàn)證的方法對(duì)內(nèi)毒素水平進(jìn)行評(píng)估。每份指示劑中的內(nèi)毒素水平和用于測(cè)試的指示劑數(shù)量必須足夠確保在除熱原工藝減少內(nèi)毒素之后，仍能準(zhǔn)確測(cè)量出內(nèi)毒素的量。內(nèi)毒素應(yīng)進(jìn)行樣品的回收試驗(yàn)，回收率通常不低于25%［10］。
2.3 除熱原驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)
在除熱原驗(yàn)證中，一般將不小于 1 000 IU 的細(xì)菌內(nèi)毒素加入待除熱原的物品中。若采用烘箱干熱滅菌對(duì)包材除熱原，則應(yīng)該在烘箱中不少于10個(gè)溫度探頭（包括從烘箱負(fù)載溫度分布研究中確定的最冷點(diǎn)）附近至少每個(gè)位置取5個(gè)樣品，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。若采用隧道烘箱對(duì)包材除熱原，應(yīng)在隧道中每個(gè)溫度探頭（包括負(fù)載溫度分布研究中確定的最冷點(diǎn)）附近至少取5個(gè)樣品，進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查［12］。通常驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)為可回收內(nèi)毒素減少至少3個(gè)對(duì)數(shù)值。
歐洲、美國(guó)、中國(guó)均制定了除熱原工藝驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)，匯總?cè)缦拢海?）《歐洲藥典》11.2“5.1.2注射劑生產(chǎn)中所用材料除熱原”章節(jié)中明確指出“工藝驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)為可回收內(nèi)毒素減少至少 3 個(gè)對(duì)數(shù)值”［6］。（2）FDA 發(fā)布的《無(wú)菌工藝生產(chǎn)的無(wú)菌藥品-現(xiàn)行藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》“Ⅵ. 成分和容器/密封件”章節(jié)中明確指出“驗(yàn)證研究數(shù)據(jù)應(yīng)證明該操作減少內(nèi)毒素含量至少 99.9%（3 個(gè)對(duì)數(shù)）”［14］。（3）《美國(guó)藥典》2023 年版中關(guān)于除熱原工藝驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)的觀點(diǎn)有所不同 ，“1228 干熱除熱原”［15］和“1228.4 沖洗除熱原”［15］章節(jié)認(rèn)為應(yīng)在充分了解產(chǎn)品和除熱原工藝能力的基礎(chǔ)上，確定適當(dāng)?shù)膬?nèi)毒素對(duì)數(shù)減少量和產(chǎn)品的內(nèi)毒素限度要求，例如干熱除熱原要求不超過0.1 EU；彈性體密封件通常很少或沒有檢測(cè)到內(nèi)毒素，其沖洗除熱原可接受下降2個(gè)對(duì)數(shù)單位；對(duì)于本身內(nèi)毒素很高的材料減少3個(gè)對(duì)數(shù)單位的限度則可能仍是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。（4）國(guó)內(nèi)發(fā)布的《藥品 GMP 指南：無(wú)菌藥品》［10］和《中國(guó)藥典》2020年版中“1421 滅菌法”章節(jié)中均明確指出“一般將不小于1 000 IU的細(xì)菌內(nèi)毒素加入待除熱原的物品中，證明該除熱原工藝能使內(nèi)毒素至少下降3個(gè)對(duì)數(shù)單位”［16］。
2.4 除熱原再驗(yàn)證
當(dāng)設(shè)備、工藝、包材發(fā)生變更時(shí)，應(yīng)對(duì)變更進(jìn)行評(píng)估，以確定這些變更的潛在影響，并應(yīng)證明變更后除熱原能力仍滿足要求。通過對(duì)設(shè)備、工藝、包材變更的評(píng)估，來確定是否需要再驗(yàn)證［10］。
3、 結(jié)語(yǔ)
目前，隨著化學(xué)藥品注射劑一致性評(píng)價(jià)工作的不斷推進(jìn)以及相關(guān)指南陸續(xù)發(fā)布，直接接觸產(chǎn)品內(nèi)包材除熱原研究及驗(yàn)證逐步成為注射劑研發(fā)及審評(píng)的重要關(guān)注內(nèi)容之一。與此同時(shí)，審評(píng)工作中也發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)人在開展包材除熱原研究驗(yàn)證時(shí)仍存在一些問題。例如，部分企業(yè)對(duì)包材除熱原驗(yàn)證的重要性認(rèn)識(shí)不足，在申報(bào)資料中未提交包材除熱原的相關(guān)研究驗(yàn)證資料，或提交《生產(chǎn)工藝信息表》缺少包材除熱原工藝的關(guān)鍵工藝描述及相關(guān)參數(shù)；部分企業(yè)未根據(jù)相關(guān)法規(guī)及指南要求提交驗(yàn)證資料，對(duì)僅提供除熱原設(shè)備驗(yàn)證報(bào)告，未結(jié)合申報(bào)品種及包材特性對(duì)除熱原工藝進(jìn)行有針對(duì)性的評(píng)估和分析，未提供合理的驗(yàn)證方案和報(bào)告；部分企業(yè)未提供充分的證明性材料，如采用的包材的除熱原操作由包材供應(yīng)商完成，但未提供由供應(yīng)商出具的除熱原相關(guān)驗(yàn)證資料及檢驗(yàn)結(jié)果。
為了保證化學(xué)藥品注射劑的安全性，企業(yè)應(yīng)充分重視直接接觸藥品包材熱原的控制。企業(yè)應(yīng)根據(jù)相關(guān)法規(guī)及指南，基于包材類型及材料的性質(zhì)，選擇合適的除熱原工藝，并對(duì)除熱原工藝進(jìn)行驗(yàn)證。為了驗(yàn)證除熱原工藝的有效性，一般通過在確定的最難除熱原的位置添加合適的內(nèi)毒素指示劑來進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證中應(yīng)合理選擇和應(yīng)用內(nèi)毒素指示劑，同時(shí)制定合理的除熱原驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。此外，在生產(chǎn)中通過對(duì)原輔料的有效控制、生產(chǎn)過程控制等其他除熱原措施的合理制定，最終實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品熱原水平的有效控制，保障注射劑安全性。
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