老人和兒童是兩群最敏感且需要重點(diǎn)關(guān)注和保護(hù)的群體。目前尚沒(méi)有針對(duì)老年人群的特定指導(dǎo)原則，但針對(duì)兒童和青少年藥物的非臨床評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則，F(xiàn)DA、EMA和ICH等均有發(fā)布。2009年，美國(guó)46%的藥物標(biāo)簽顯示可用于兒童。然而，兒童并不是小號(hào)的成年人，基于成年人數(shù)據(jù)上市的藥物給予兒童標(biāo)簽外用藥是有重大安全性風(fēng)險(xiǎn)的。兒童在解剖、生理、發(fā)育方面的差異導(dǎo)致對(duì)于藥物代謝、腎臟清除、藥物-藥物相互作用及毒性敏感度等方面與成人可能是不同的。很多藥物在幼齡人群和成年人中的毒性表現(xiàn)也是有區(qū)別的，比如氯霉素由于在幼齡人群中的半衰期和暴露量增加，會(huì)增加新生兒的死亡率。又如吸入型糖皮質(zhì)激素會(huì)影響兒童的生長(zhǎng)速度。因此，對(duì)于臨床擬用人群有未成年人的情況，需要在幼齡動(dòng)物中開(kāi)展非臨床風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
幼齡動(dòng)物毒性評(píng)價(jià)最核心的關(guān)注點(diǎn)是出生后重要器官的發(fā)育毒性。比如大腦神經(jīng)發(fā)育會(huì)持續(xù)整個(gè)青春期（Adolescence），腎臟功能和胃腸道系統(tǒng)功能在1歲左右才達(dá)到成人水平，肺泡成熟通常在2歲左右，免疫球蛋白IgG和IgA在5-12歲時(shí)達(dá)到成年人水平，生殖系統(tǒng)在青春期才完全成熟，骨骼系統(tǒng)更是要到25-30歲發(fā)育結(jié)束。因此，根據(jù)藥物的用藥人群年齡不同，可能影響的器官發(fā)育、功能也會(huì)有所區(qū)別。
而幼齡動(dòng)物研究結(jié)果在臨床兒童轉(zhuǎn)化方面是具有重要價(jià)值的。比如通過(guò)研究發(fā)育中的嚙齒動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)了苯巴比妥對(duì)兒童認(rèn)知能力的影響。通過(guò)研究六氯苯酚對(duì)發(fā)育中大鼠和猴的神經(jīng)毒性，成功提示了臨床新生兒的對(duì)應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)未發(fā)育成熟心臟對(duì)鈣離子阻斷劑更為敏感，這一結(jié)論對(duì)維拉帕米引起嬰兒心血管并發(fā)癥發(fā)生率增加有重要提示價(jià)值。茶堿在幼齡動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的驚厥副作用，也在臨床幼年人群中得以驗(yàn)證。
幼齡動(dòng)物非臨床研究已經(jīng)有一系列指南和電子刊物發(fā)布，羅列如下：
1）FDA，2006，Guidance for Industry: Nonclinical Safety Evaluation of Pediatric Drug Products.
2）EMA，2008，Guideline on the Need for Nonclinical Testing in Juvenile Animals on Human Pharmaceuticals for Pediatric Indications.
3）JMHLW，2012，Guideline on Nonclinical Safety Studies in Juvenile Animals for Pediatric Drug Development.
4）ICH S11，2020，NONCLINICAL SAFETY TESTING IN SUPPORT OF DEVELOPMENT OF PAEDIATRIC PHARMACEUTICALS.
5）NMPA，2017，兒科用藥非臨床安全性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見(jiàn)稿）。
6）黃芳華，王慶利等，2017，《幼齡動(dòng)物毒理學(xué)研究: 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施和結(jié)果分析》。
7）單曉蕾，黃芳華等，2022，《幼齡動(dòng)物毒理學(xué)試驗(yàn)的案例分析及考慮要點(diǎn)》。
當(dāng)然ICH M3、ICH S6、ICH S9等指南對(duì)于符合特定產(chǎn)品分類、適應(yīng)癥或通用要求的也是可以參照的。
那么什么情況下需要開(kāi)展幼齡動(dòng)物毒理研究呢？
籠統(tǒng)的講，當(dāng)現(xiàn)有的臨床數(shù)據(jù)、非臨床數(shù)據(jù)不能支持藥物在兒童患者中的安全性時(shí)，幼齡動(dòng)物的非臨床研究就有了必要性。比如：1）同類型產(chǎn)品（包括同靶點(diǎn)、同作用機(jī)制、相似機(jī)制等）如果已經(jīng)有針對(duì)幼齡動(dòng)物毒性的擔(dān)憂；2）本品的臨床研究已有充分?jǐn)?shù)據(jù)提示潛在的風(fēng)險(xiǎn)；3）非臨床成年動(dòng)物研究數(shù)據(jù)顯示出發(fā)育毒性風(fēng)險(xiǎn)，或者提示有某些方面的特別擔(dān)憂，需開(kāi)展進(jìn)一步研究，如毒性的可逆性、充分的安全窗口探索等；4）現(xiàn)有臨床、非臨床安全性數(shù)據(jù)對(duì)于擬用于兒童的支持是不充分的。對(duì)于大部分藥物，在用于兒童之前，其實(shí)已經(jīng)有了成年人的安全性和有效性數(shù)據(jù)，甚至有些已經(jīng)有12歲以上未成年患者的數(shù)據(jù)?？梢越Y(jié)合已有的臨床前和臨床數(shù)據(jù)，科學(xué)合理設(shè)計(jì)幼齡動(dòng)物的研究方案。ICH S11對(duì)于是否需要額外開(kāi)展幼齡動(dòng)物非臨床安評(píng)，建議進(jìn)行證據(jù)權(quán)重分析，其中最重要的考量因素是臨床擬用患者的最小年齡以及對(duì)發(fā)育中器官系統(tǒng)是否有可疑影響，其它考量因素還包括前期資料完整度、藥物靶點(diǎn)對(duì)器官發(fā)育的作用、藥物的選擇性和特異性等，如下圖所示。ICH S11附錄中關(guān)于證據(jù)權(quán)重分析決定幼齡動(dòng)物非臨床安評(píng)是否需要開(kāi)展給出了多個(gè)案例，可以參考。
對(duì)于先用于兒科或兒科專用藥物，如果可能，建議先進(jìn)行成年健康志愿者試驗(yàn)。再根據(jù)成年動(dòng)物非臨床數(shù)據(jù)、成年健康人體數(shù)據(jù)等進(jìn)行證據(jù)權(quán)重分析。對(duì)于無(wú)法實(shí)現(xiàn)成年健康志愿者給藥，也無(wú)成年動(dòng)物數(shù)據(jù)支持的情況，就需要開(kāi)展比較全面的幼齡動(dòng)物非臨床研究，包括幼齡嚙齒和幼齡非嚙齒類動(dòng)物一般毒理、安全藥理學(xué)、遺傳毒性等。
研究設(shè)計(jì)和考量
幼齡動(dòng)物毒理研究多以嚙齒類為主，先從整體看下一項(xiàng)嚙齒類幼齡動(dòng)物毒理試驗(yàn)，如下圖所示。除了常規(guī)體重、攝食量、臨床病理、組織病理學(xué)檢查、眼科檢查外，需要特別關(guān)注骨骼、神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等發(fā)育情況。另外，可以考慮將功能觀察組合測(cè)試（functional observation battery, FOB）嵌入一般毒性試驗(yàn)中。
種屬選擇方面，選擇依據(jù)與成年動(dòng)物類似。如果前期已經(jīng)完成成年動(dòng)物毒理研究，且已經(jīng)有成年人體數(shù)據(jù)，F(xiàn)DA、EMA、ICH均認(rèn)為采用一種最相關(guān)種屬開(kāi)展幼齡動(dòng)物毒理研究即可。來(lái)自10家藥企的39個(gè)幼齡動(dòng)物毒理數(shù)據(jù)顯示，大鼠是最常用種屬。但是，如果擬開(kāi)發(fā)產(chǎn)品是兒科專用或先是兒科的適應(yīng)癥，這種情況下沒(méi)有前期成年動(dòng)物、臨床數(shù)據(jù)支持，通常需要在兩個(gè)種屬（嚙齒+非嚙齒）幼齡動(dòng)物中開(kāi)展研究，感興趣的可翻閱下脊髓性肌萎縮癥治療藥物諾西那生鈉（nusinersen，商品名Spinraza）的相關(guān)資料。大鼠作為最常用種屬，優(yōu)點(diǎn)是比較經(jīng)典，歷史對(duì)照資料豐富，發(fā)育時(shí)間短，可進(jìn)行大量發(fā)育重點(diǎn)指標(biāo)的考察，易于操作等。當(dāng)然，大鼠也有其局限性，具體優(yōu)、缺點(diǎn)如下表所示。
對(duì)于生物制品，如果大鼠不是相關(guān)種屬怎么辦？用非人靈長(zhǎng)類（non-human primate，NHP）開(kāi)展幼年動(dòng)物毒理研究嗎？NHP開(kāi)展幼齡動(dòng)物毒理研究非常具有挑戰(zhàn)性，離乳前用藥涉及繁殖、運(yùn)輸和母體/嬰仔對(duì)的處理，離乳后（大約6個(gè)月齡）器官系統(tǒng)的成熟度通常已超過(guò)許多兒科相關(guān)年齡。如果有成年動(dòng)物發(fā)育和生殖毒理學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，主要是圍產(chǎn)期發(fā)育毒性試驗(yàn)，可能足以支持兒科研究的非臨床風(fēng)險(xiǎn)。如果沒(méi)有，可以考慮采用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、替代分子或者其它體外試驗(yàn)系統(tǒng)等方案解決。
研究用動(dòng)物所屬年齡段與臨床擬暴露人群的年齡應(yīng)該具有可比性，給藥起始年齡應(yīng)與臨床擬用最小年齡相當(dāng)。下圖是不同種屬動(dòng)物和人體年齡對(duì)比示例圖。
幼齡動(dòng)物一般不太建議從出生當(dāng)天就開(kāi)始給藥，有可能會(huì)影響動(dòng)物的存活率。根據(jù)給藥途徑不同，種屬不同，允許最早起始給藥時(shí)間如下表所示。
對(duì)需離乳前給藥的，一般持續(xù)1-3個(gè)月。對(duì)于幼齡大鼠，PND2-4，PND7和PND21開(kāi)始給藥，可以分別支持新生兒、1個(gè)月的嬰兒和2歲兒童的臨床試驗(yàn)。給藥結(jié)束時(shí)動(dòng)物的年齡應(yīng)該是睪丸真正的成熟后（約PND59-63），或者至少覆蓋了發(fā)育的關(guān)鍵窗口期。這也是為什么大鼠使用最多的一個(gè)原因，從開(kāi)始發(fā)育到性成熟的周期短。犬和小型豬的發(fā)育窗口期比大鼠長(zhǎng)很多，非人靈長(zhǎng)類就更不實(shí)用了。給藥起始年齡不合適是審評(píng)中的常見(jiàn)問(wèn)題，需要特別關(guān)注。
劑量選擇方面，F(xiàn)DA建議探索出清晰的劑量-效應(yīng)關(guān)系。高劑量應(yīng)產(chǎn)生可識(shí)別的毒性，如發(fā)育毒性或一般毒性。中劑量最好也產(chǎn)生一定程度的毒性反應(yīng)。低劑量則產(chǎn)生輕微毒性或不產(chǎn)生毒性，如果可能，最好是NOAEL劑量。幼齡動(dòng)物毒性可能比成年動(dòng)物更為敏感，也可能更不敏感，簡(jiǎn)單從成年動(dòng)物數(shù)據(jù)推導(dǎo)幼齡動(dòng)物并不合理，建議在開(kāi)展幼齡動(dòng)物正式毒理研究之前，先開(kāi)展預(yù)試驗(yàn)進(jìn)行劑量探索。另外，要避免毒性劑量水平過(guò)高導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育遲緩而引起器官系統(tǒng)的繼發(fā)性影響和/或母體忽略/拒絕哺乳幼仔。對(duì)體重產(chǎn)生明顯影響可能會(huì)混淆終點(diǎn)判斷。
給藥途經(jīng)方面，給藥途經(jīng)要求與成年動(dòng)物研究類似，與臨床擬用途徑保持一致。如果無(wú)法實(shí)現(xiàn)，需要說(shuō)明采用替代途徑給藥的原因及合理性。兒童最常見(jiàn)的給藥途徑是口服，且因吞咽膠囊或片劑的難度，液體制劑的設(shè)計(jì)更為合理。嚙齒類動(dòng)物口服給藥，通常最早開(kāi)始給藥的時(shí)間是出生后第4或7天（PND4或PND7）。如果計(jì)劃出生后就開(kāi)始用藥，推薦腹腔或皮下注射。年齡特別小的動(dòng)物，靜脈注射給藥難度很大，不是所有實(shí)驗(yàn)室均能熟練操作。另外，給藥體積也需要特別注意，對(duì)于嚙齒類動(dòng)物，不同的給藥途徑，其給藥體積或適用年齡如下: 1）口服：5 mL/kg，超過(guò)此給藥容量會(huì)影響攝食；2）皮下給藥：3-5 mL/kg，適合于PND 4 或更大年齡動(dòng)物。開(kāi)始時(shí)一般3個(gè)注射部位（肩胛、腰椎左右）給藥，在成長(zhǎng)過(guò)程中，最多可對(duì)5個(gè)部位給藥；3）靜脈注射：靜脈推注為5mL/kg，小于PND18 不能重復(fù)靜脈注射給藥；4）吸入給藥：離乳前采用全身暴露的方式，無(wú)法吸入給藥；鼻腔給藥僅可在離乳后；5）經(jīng)皮給藥: 僅在離乳后可行。
TK采血方面，細(xì)胞色素P450酶、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體和激素隨著發(fā)育而變化，造成藥物在吸收、分布、代謝和排泄方面的差異，是導(dǎo)致兒童/青少年患者與成年人群毒性反應(yīng)敏感性不同的主要原因。因此，試驗(yàn)中包含TK 參數(shù)非常重要。通常一般毒理試驗(yàn)中會(huì)設(shè)置衛(wèi)星組，采血時(shí)間點(diǎn)通常設(shè)置在首末次給藥。另外，由于幼齡動(dòng)物采血量有限，TK方法開(kāi)發(fā)時(shí)盡量減少分析所用樣本體積，能實(shí)現(xiàn)微量檢測(cè)當(dāng)然最好，否則TK衛(wèi)星組可能要設(shè)置比較多的動(dòng)物用于采血。還有一點(diǎn)需要注意，由于動(dòng)物在快速發(fā)育，這其中就包括前述代謝酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體，所以幼齡動(dòng)物研究周期中的TK暴露量可能會(huì)出現(xiàn)較大的波動(dòng)。
分組設(shè)計(jì)方面，由于幼齡動(dòng)物通常在離乳前即開(kāi)始給藥，必須考慮同窩幼仔的分組問(wèn)題。常用的分組方法包括分窩設(shè)計(jì)（split-litter design）、整窩設(shè)計(jì)（whole-litter design）、交叉哺育（cross-fostering）。分窩設(shè)計(jì)指同一窩幼仔平均分配到各劑量組（in split-litter design, all dose levels should be equally represented within a litter），缺點(diǎn)是有交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。整窩設(shè)計(jì)指每窩幼仔接受同一劑量給藥（in whole-litter design, all pups from the same litter get the same dose），優(yōu)點(diǎn)是解決了交叉污染風(fēng)險(xiǎn)，缺點(diǎn)是無(wú)法排除窩效應(yīng)和遺傳效應(yīng)的影響。交叉哺育可以最小化窩效應(yīng)和遺傳效應(yīng)影響，但又會(huì)存在非自然哺育引入的哺育效應(yīng)的問(wèn)題。當(dāng)然，如果不涉及離乳前用藥，分組需要考量的因素就會(huì)簡(jiǎn)化很多。
ICH S11推薦的分組方案是先構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)窩，大多數(shù)幼仔與自然母親仍然在一起，每窩幼仔數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化（比如5雌5雄），10窩為1個(gè)劑量組，下圖所示就是1個(gè)劑量組的動(dòng)物組成，A-J代表10窩，每窩10只動(dòng)物，5雌和5雄代表了5個(gè)亞組，分別用于不同的試驗(yàn)?zāi)康模械氖墙o藥結(jié)束剖檢用，有的是TK用，有的是CNS行為學(xué)評(píng)估用。這種設(shè)計(jì)有點(diǎn)類似整窩設(shè)計(jì)，通過(guò)多窩組合減少窩效應(yīng)和遺傳效應(yīng)等混雜因素影響。
檢測(cè)指標(biāo)：通常，幼齡動(dòng)物毒理研究需要關(guān)注出生后器官發(fā)育的影響比如骨骼、腎臟、肺、神經(jīng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)。終點(diǎn)指標(biāo)應(yīng)包括很多生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)如冠臀長(zhǎng)度、股骨和脛骨長(zhǎng)度、性成熟的外部指征、體重、體征、臨床病理學(xué)、器官重量、大體解剖和鏡檢。下圖摘自黃芳華、王慶利等CDE老師發(fā)表的《幼齡動(dòng)物毒理學(xué)研究: 試驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施和結(jié)果分析》一文，除了常規(guī)指標(biāo)，還需要結(jié)合藥物的靶點(diǎn)生物學(xué)特征、前期成年動(dòng)物毒理學(xué)數(shù)據(jù)、臨床使用等case by case的設(shè)置針對(duì)性特殊評(píng)價(jià)指標(biāo)。
最后
幼齡動(dòng)物的非臨床研究非常復(fù)雜。首先，對(duì)于是否需要開(kāi)展附加的幼齡動(dòng)物非臨床研究進(jìn)行系統(tǒng)的證據(jù)權(quán)重分析，不是所有兒科臨床研究均需要幼齡動(dòng)物數(shù)據(jù)支持。其次，動(dòng)物給藥初始年齡選擇、給藥持續(xù)時(shí)間也需要結(jié)合臨床擬用人群、動(dòng)物與人體器官發(fā)育的比較等進(jìn)行謹(jǐn)慎評(píng)估。再就是劑量選擇，并不是劑量越高越好，反而過(guò)猶不及，會(huì)因?yàn)橄到y(tǒng)毒性影響對(duì)器官發(fā)育的評(píng)估。分組設(shè)計(jì)較成年動(dòng)物的考量因素復(fù)雜很多，需要排除各種混雜因素的影響。終點(diǎn)指標(biāo)的檢測(cè)除納入成年動(dòng)物毒理研究所選擇的常規(guī)指標(biāo)，還需對(duì)器官系統(tǒng)的發(fā)育進(jìn)行重點(diǎn)研究，某些靶點(diǎn)相關(guān)的特殊評(píng)價(jià)指標(biāo)也需要結(jié)合實(shí)際情況case by case分析。簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單一篇文章很難全面、系統(tǒng)的將幼齡動(dòng)物非臨床研究細(xì)節(jié)分析透徹，好在ICH、FDA、EMA等已經(jīng)有多個(gè)指導(dǎo)文件出臺(tái)，也有大量已經(jīng)上市的藥物開(kāi)展過(guò)幼齡動(dòng)物非臨床研究，公開(kāi)發(fā)表的文獻(xiàn)就更多了，足以用來(lái)參考。
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