摘 要
聚乙二醇化重組蛋白藥物是由聚乙二醇（PEG）對重組蛋白藥物修飾而成，在保留原型重組蛋白生物學活性前提下，克服原型蛋白體內代謝快、穩(wěn)定性差、需多次給藥等缺點，但也存在一定的特殊性，在對其質量控制的相關指導原則有限的情況下，通過對其生產用原材料控制、生產過程中工藝控制、中間產品及終產品的質量控制、穩(wěn)定性研究等方面進行探討，為其研究開發(fā)和生產質量控制提供一定參考。
聚乙二醇化重組蛋白藥物是通過聚乙二醇（PEG）端基與重組蛋白藥物的氨基酸序列側鏈基團或N末端、C末端氨基/羧基發(fā)生共價反應修飾而成的治療性生物制品，目的是在保留原型重組蛋白生物學活性前提下，克服原型蛋白體內代謝快、穩(wěn)定性差、需多次給藥等缺點，同時PEG修飾后具有提高重組蛋白藥物穩(wěn)定性或者降低其免疫原性等優(yōu)點。自1990年美國食品藥品監(jiān)督管理局批準第一種PEG化蛋白藥物(PEG-牛腺苷脫氨酶，Adagen)，該類藥物研發(fā)迅速成為行業(yè)內布局長效化蛋白藥物的一種途徑。當前發(fā)展趨向于通過控制聚合反應條件，結合PEG端基化學改構和基因工程技術，實現(xiàn)PEG定點修飾。已上市的PEG化重組蛋白藥物包括干擾素、生長激素拮抗藥、促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子等，均取得了不錯的治療效果和經(jīng)濟效益。相比較原型蛋白，PEG化重組蛋白在生產用原材料控制、生產過程工藝控制、中間產品及終產品的質量控制、穩(wěn)定性研究等方面都存在一定的特殊性，本文將從以上幾個方面對該類制品的質量控制一般策略進行歸納和總結，以便于行業(yè)對產品控制做進一步的思考。
1、 生產用原材料控制
1.1 原型蛋白質量控制
蛋白表達系統(tǒng)涉及大腸桿菌、酵母菌及哺乳動物細胞等多種系統(tǒng)，不同系統(tǒng)表達重組蛋白翻譯后修飾水平存在明顯差異，其質量控制手段也各不相同，在原型蛋白的制備過程中關注發(fā)酵及純化工藝對相關工藝與產品雜質的控制及去除能力，以便于后續(xù)偶聯(lián)修飾時減少不必要的干擾。
明確對用于PEG修飾的原型蛋白的質量控制標準，原則上應不低于原型蛋白質量標準控制的要求，必要時用于PEG修飾的原型蛋白質量標準的某些項目應高于原標準規(guī)定，如純度項目等。
1.2 PEG的質量控制要求
PEG是由環(huán)氧乙烷聚合而成一種不帶電荷的聚合物，分子量大小可根據(jù)工藝需要自行控制。由于修飾目標蛋白的不同，需使用不同活化形式PEG，官能化PEG是一類具有官能性基團的PEG衍生物，又稱作活性PEG。該原料是生產過程中的主要物料，對產品質量起到關鍵作用。加強對修飾物料的質量控制，保證批間一致性，明確其關鍵質量屬性（包括活性基團種類、擬成鍵鍵型、分子形態(tài)、分子量范圍等）的質量標準并進行控制。
物料PEG控制至少應包括以下項目，并對其方法的準確性進行驗證或確認：平均分子量及多分散度、端基活性、端基取代率、殘留溶劑、二丁基羥基甲苯（BHT）含量、細菌內毒素。加強對使用的PEG中可能存在的雙醇、斷裂與非活化PEG等特定雜質及其他需要控制的相關雜質的分析及限量控制。
因官能化PEG本身穩(wěn)定性較差，在對其貯存、分裝和使用過程中的條件應進行規(guī)定，防止高溫、氧化和潮解等環(huán)境因素使其活化基團失活，從而導致修飾效率的降低。不同供應商的PEG物料一般不混合使用。
1.3 其他生產用原輔料
PEG化重組蛋白制品生產中涉及的物料包括原材料、輔料、關鍵耗材、內包裝材料等，應基于中國藥典2020版相關要求、對產品質量的影響、對生產工藝的關鍵性確定風險等級并開展相應的評估，采取與之相對應的管理方式，包括供應商管理、物料驗收、檢驗、儲存、放行、使用等要求。
任何關鍵物料的變更，都應按照國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（CDE）發(fā)布的《已上市生物制品藥學變更研究技術指導原則（試行）》的要求，對變更進行充分地研究及必要的驗證，以證明對上市后PEG化重組蛋白制品的質量和療效不產生不利影響。
2、 生產過程工藝控制
嚴格按照經(jīng)批準的制造與檢定規(guī)程組織生產和質量控制，并按照經(jīng)驗證的工藝時限、環(huán)境及其他要求嚴格控制生產過程。關注工藝的過程控制，包括產品質量屬性和工藝參數(shù)，控制措施應有能力確保產品滿足既定的質量屬性及可接受標準。
保持工藝驗證的連續(xù)性和一致性。生產工藝應經(jīng)過至少連續(xù)3批的工藝驗證，以確認批次內的均一性和批次間的穩(wěn)定性。首次工藝驗證時，制劑生產使用的原液也應為工藝驗證批次，驗證的內容須能確定藥品的關鍵質量屬性滿足可接受標準，并有額外檢測項目和取樣考慮，以確保藥品的有效性和安全性。工藝驗證的項目應至少包括工藝穩(wěn)健性、細胞或菌體生長曲線、表達量分析、雜質去除能力檢測、過程控制參數(shù)匯總以及半成品的混合均一等。
PEG修飾方式包括定點、單位點隨機或多位點隨機修飾等方式，修飾工藝的選擇應設定適宜的反應條件，以降低重組原型蛋白藥物的活性損失及可能的修飾副產物。修飾過程中采取必要的控制措施減少修飾產物的不均一和異構體的產生，后續(xù)的純化工藝確保將非目的修飾產物控制到質量標準的范圍內；修飾過程中嚴格按照經(jīng)批準的工藝規(guī)程進行操作，禁止為實現(xiàn)特異性定點修飾而非法添加其他無法在后續(xù)純化工藝中去除的物料；修飾過程中建立適宜的工藝過程控制，以保證偶聯(lián)反應的批間一致性，設定關鍵工藝參數(shù)的可接受限值范圍，包括PEG的加入方式、PEG與原型蛋白的投料比、緩沖液的組成及酸堿度、反應條件等；采用適宜的方法對修飾反應的修飾液中原型蛋白修飾率進行控制，防止原型蛋白未修飾或過度修飾的量超出控制范圍。
生產過程中各種緩沖液的儲存應有儲存條件及時限規(guī)定，并有驗證數(shù)據(jù)的支持；緩沖液的儲存應有避免微生物和內毒素污染的措施，且緩沖液應在規(guī)定的有效期內使用；對關鍵工藝步驟，如原型蛋白原液純化等中間步驟建立微生物限度及內毒素控制質量標準，并按規(guī)定進行檢測。
不同生產階段純化須分別使用專用的層析介質，不得混用；不同批次之間，應當對層析分離柱進行清潔或消毒，必要時應定期對層析介質的柱效進行測定。
未經(jīng)注冊批準、修飾率不符合要求的修飾后原液及中間產物不得進行返工及重新加工。
3、 中間產品及終產品的質量控制
PEG化重組蛋白藥物的質量控制與修飾蛋白的分子大小、修飾位點與修飾程度、結構特征、質量屬性復雜程度以及生產工藝等息息相關。應采用適宜方法對原液質量進行檢測，必要時應與參比品進行比較。原液的含量測定方法與成品制劑的含量測定方法顯著不同時，應考慮方法之間的測定誤差，避免因此引發(fā)的原液投料偏差。
質量控制應關注修飾前后其關鍵質量屬性的變化，如生物學活性、修飾位點、分子大小變異體、電荷變異體以及高級結構、游離PEG含量、修飾度及必要的雜質檢測等；關注工藝和產品相關雜質的情況，尤其是游離PEG含量、未修飾原型蛋白、過修飾蛋白、溶劑殘留等指標；關注修飾工藝對原型蛋白一級結構（如氨基酸序列完整性、二硫鍵連接）、糖基化修飾和翻譯后修飾（如有）等的影響。關注穩(wěn)定性考察PEG化重組蛋白制品（原液、制劑及必要中間體）儲存過程中PEG的脫落情況以及多聚體產生情況，任何超趨勢情況都應進行調查。
采用不同的分析方法多角度對修飾后產物的純度開展檢測，方法至少應包括反相高效液相色譜（RP-HPLC）純度和體積排阻色譜（SEC-HPLC）純度或者其他2種以上純度分析方法等。分析方法在不同PEG化蛋白制品中應經(jīng)驗證，并有適宜的分離度和信噪比，以保證方法的準確性。RP-HPLC純度檢測，因PEG疏水性較強，經(jīng)過修飾后制品的疏水性變強，而多修飾PEG制品比單修飾制品疏水性更強。利用反相高效液相層析的不同有機相濃度，實現(xiàn)未修飾、單修飾和過修飾制品的分離，從而可以檢測目的產物的雜質含量。SEC-HPLC純度檢測，應用分子篩層析原理，分子量大的蛋白質在層析柱中移動速度快，而分子量小的蛋白質移動速度慢，根據(jù)移動速度不同，能夠分離檢測出不同分子量的未修飾、單修飾和過修飾制品。
產品肽圖與平行測定的參考品比較確定一致性，建立產品專屬的肽圖鑒別方法，如與原型蛋白相同的方法，應對其方法適用性和試驗條件進行充分的方法學驗證，使得通過比較修飾前后制品的肽圖，可直觀分析發(fā)生修飾的肽段位置。
采用適宜的方法及對照品對修飾后產物進行蛋白質含量的測定，測定時通過適宜的方法排除PEG等物料對Folin-酚法等常規(guī)蛋白含量測定方法的干擾。
對原型蛋白PEG修飾程度進行控制，包括但不限于以下內容：修飾率、修飾位點異構體相對含量、PEG修飾個數(shù)范圍及相關含量、修飾產物分子量分布、等電點等項目，該部分內容可在原液生產階段加以控制，以保證工藝去除雜質的能力。
基于不同產品考慮，選用適宜方法對修飾后產物進行氧化產物、脫酰胺產物、游離PEG含量、原型蛋白及結構不完整分子定量分析，對宿主蛋白、外源性DNA及其他工藝雜質如修飾劑、催化劑、有機溶劑等殘留物進行控制。通過串聯(lián)離子交換和尺寸排阻色譜法或其他適宜的方法將游離PEG從PEG化重組蛋白制品中分離出來，并用蒸發(fā)光檢測器進行檢測，通過與PEG標準曲線比較進行定量分析，計算制品中游離PEG的含量并嚴格進行控制；檢驗中關注PEG標準溶液的穩(wěn)定性問題。
原則上應采用同質參考品用于產品的質量控制，如采用原型蛋白等替代參考品，對其適用性進行充分驗證，如PEG化重組蛋白已證明對原型蛋白的生物學活性等指標確有影響，則必須制備并采用同質參考品用于質量控制。參考品的有效期基于穩(wěn)定性考察得到，在考察過程中有能夠檢測參考品結構和特性發(fā)生變化的檢測項目；在新制備參考品時，應按照要求對新批次參考品進行檢定，包括結構分析和表征研究，同時與初始或上一代參考品開展橋接實驗。
4、 穩(wěn)定性研究方面一般要求
PEG化重組蛋白藥物對環(huán)境非常敏感，易受外界因素影響，特別是溫度、光照等因素，制品在較長時間、較高溫度及暴露于強光下，易產生聚合體及電荷異構體，為保證最終產品的質量，在設計穩(wěn)定性試驗時重點關注相關條件下產品的穩(wěn)定性，包括中間產品穩(wěn)定性、原液及成品的穩(wěn)定性、容器相容性及對產品穩(wěn)定性的影響等內容。
通過穩(wěn)定性研究，明確產品的敏感條件及儲存要求，具體可參照《中國藥典》2020版9402 生物制品穩(wěn)定性試驗指導原則，重點關注以下內容：穩(wěn)定性樣品應能代表商業(yè)化規(guī)模下產品的質量，用于穩(wěn)定性研究的成品應來自不同批次的原液；原液及產品的包裝容器及密封系統(tǒng)應盡量與實際保持一致；由于該類產品結果的復雜性，采用單一的檢測方法不能完全反映該類產品穩(wěn)定性的特征，應基于產品的實際情況，對不同階段的產品（如中間產品、原液、成品）開展穩(wěn)定性研究，以全面反映各個階段產品的質量符合預期目的；穩(wěn)定性考察過程中應重點關注在不同考察時間點、不同條件下游離PEG的含量及未修飾原型蛋白、過修飾蛋白的變化情況，對于研究過程中的偏離情況應及時進行調查，以便于發(fā)現(xiàn)產品質量的不符合性。
5、 討 論
重組蛋白制品的長效化研究是未來發(fā)展的必然趨勢，機遇與挑戰(zhàn)并存。相比于原型重組蛋白存在的缺點，PEG化重組蛋白具有更好的臨床應用上的便利性與成本效益，隨之具有廣闊的市場前景，近年來越來越多的PEG化重組蛋白藥物已經(jīng)進入臨床審批階段。但同時，PEG化重組蛋白藥物也暴露出一些問題，如PEG對蛋白藥物空間屏蔽的作用會減弱蛋白藥物與受體的相互作用，降低蛋白藥物的生物活性，且PEG分子質量越大活性降低越多；高分子質量PEG在體內不易被代謝，容易聚集在肝等部位而引起大分子綜合征，長期使用可能會對肝造成損傷；偶聯(lián)在蛋白藥物上的PEG可能會誘導產生抗PEG抗體，降低藥效和安全性等特點，該類產品在研發(fā)及上市后應更加關注工藝的一致性及產品的安全有效性。
考慮到該類產品的特殊性，在CDE 2015年發(fā)布的《生物類似藥研發(fā)與評價技術指導原則（試行）》中提到對PEG化等修飾的產品，在按照生物類似藥研發(fā)時應慎重考慮?；谫|量源于設計的理念，PEG化重組蛋白在前期的研發(fā)中設計符合要求的分子結構，生產過程中做好工藝控制與質量控制，穩(wěn)定性研究中設計合理及時發(fā)現(xiàn)不良趨勢，確保產品持續(xù)符合質量標準的要求最大限度的為患者提供質量可靠的長效治療性藥物。
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