可注射水凝膠在微創(chuàng)注射到人體后能夠原位形成固體凝膠，并能充分填充不規(guī)則的目標空間，因其在組織工程支架和局部藥物釋放載體等生物醫(yī)學應用領域的突出優(yōu)勢和巨大潛力而日益受到關注。迄今為止，人們利用化學反應和物理相互作用兩種策略實現(xiàn)其溶膠-凝膠轉變，即在注射到目標空間后形成三維網狀結構。通過這兩種策略制備的可注射分子水凝膠（IMHs）各有優(yōu)勢，但其固有的局限性也令人沮喪。例如，與點擊反應、邁克爾加成反應、席夫堿反應、酶介導反應和光交聯(lián)反應等化學反應相關的 IMHs 通常生物相容性較差，原因在于其分子鏈中存在反應基團、反應劑（如交聯(lián)劑、（光）引發(fā)劑或催化劑）或產生的中間體（如自由基），這些中間體可能與細胞生物大分子的活性基團發(fā)生反應。
來自東華大學的查劉生和Xiaoyun Liu團隊和來自上海交通大學的Xiaolong Zha 團隊合作通過縮短和分散在 pH 值為 7.4 的磷酸鹽緩沖溶液中、能在體溫下自卷曲的 Janus 纖維，制成了一種可注射的仿 ECM 水凝膠（IEMH）。纖維含量僅為 5 wt%的 IEMHs 可在體溫下發(fā)生溶膠-凝膠轉變，成為具有理想穩(wěn)定性、堅固性、彈性和自愈能力的固體凝膠。此外，它們還具有顯著的假塑性，有利于在室溫下進行注射。掃描電子顯微鏡、全內反射熒光顯微鏡、核磁共振和傅立葉變換紅外光譜儀的研究結果表明，它們在生理條件下的凝膠轉變源于熱引起的自卷曲纖維之間的緊密纏結和纖維之間的疏水相互作用的協(xié)同作用。利用 C2C12 成肌細胞進行了 MTT 試驗，以檢驗 IEMH 在生物醫(yī)學應用中的體外細胞毒性。相關工作以題為“Injectable Extracellular Matrix-mimetic Hydrogel Based on Electrospun Janus Fibers”的文章發(fā)表在2024年1月31日的國際知名期刊《Materials Horizons》。
1. 創(chuàng)新型研究內容
本研究開發(fā)了一種新型可注射水凝膠，即可注射仿 ECM 水凝膠（IEMH），它由縮短的電紡 Janus 纖維組成，能夠在體溫下自卷曲。掃描電子顯微鏡（SEM）和全內反射熒光顯微鏡（TIRFM）觀察、流變學測量、傅立葉變換紅外光譜（FTIR）和核磁共振（NMR）表征證實了這一點。采用熱響應聚（N-異丙基丙烯酰胺-4-丙烯酰二苯甲酮）（PNA）和甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）改性聚（乙烯醇）（MPVA）作為紡絲聚合物，結合紫外線（UV）輻照，通過并排（s-b-s）電紡絲工藝可大規(guī)模制備 Janus 纖維。在不使用任何有機溶劑或活性化學品的情況下，通過勻漿器將 Janus 纖維縮短并分散在 pH 值為 7.4 的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，從而制造出 IEMH。這種新型可注射水凝膠具有顯著的假塑性，有利于在室溫下注射，并在體溫下快速凝膠化。其凝膠產物的纖維結構類似于 ECM，在生理條件下具有理想的穩(wěn)定性、堅固性、彈性和自愈能力。這些獨特的特性使我們開發(fā)的 IEMH 非常適合生物醫(yī)學應用，如組織工程支架。
【體溫自卷曲Janus纖維的制備及表征】
如圖 1 所示，通過 s-b-s 電紡絲工藝并結合紫外線照射，制備出了能夠在體溫下自卷曲的 Janus 纖維。首先，通過 Nisopropylacrylamide（NIPAM）和 4-acryloylbenzophenone （ABP）的自由基共聚合成了熱響應聚（N-異丙基丙烯酰胺-4-丙烯酰二苯甲酮）（PNA），如圖 1a 所示。另一種紡絲聚合物是用甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）和二甲氨基吡啶（DMAP）作為催化劑對聚（乙烯 醇）（PVA）進行改性而制備的（見圖 1b），簡稱 MPVA。用于 TIRF 和 CLSM 表征 Janus 纖維的熒光 MPVA（FMPVA）是通過酯化作用在 MPVA 側鏈中引入過烯成分制備的。凝膠滲透色譜法（GPC）測定的共聚物的數(shù)均分子量為 8.97ⅹ104。通過 UVvis 測定，其臨界溶解溫度（LCST）為 29.2 ℃，低于通過 NIPAM 自由基聚合合成的聚異丙基丙烯酰胺（PNIPAM）均聚物的臨界溶解溫度（32 ℃），這是因為引入了疏水性 ABP 成分。此外，在紡絲溶液 B 中加入 1.0 wt% 的 I 2959 至 MPVA（圖 1c）。最后，使用這兩種紡絲溶液進行 s-b-s 電紡絲，然后用紫外線照射紡成的 PNA/MPVA Janus 纖維，如圖 1d 所示。用于 TIRF 和 CLSM 表征的 PNA/FMPVA Janus 纖維是通過相同的工藝制作的。
圖1 通過 s-b-s 電紡絲工藝制備 PNA/MPVA Janus 纖維的示意圖和表征結果
【可注射ECM模擬水凝膠的制備和可注射性】
本研究將 PNA/MPVA Janus 纖維縮短并用勻漿器分散在 pH 7.4 的 PBS 中，制備可注射的仿 ECM 水凝膠（IEMH）。通過改變勻漿時間來控制 IEMH 中縮短纖維的平均長度。根據相同的勻漿時間（3 分鐘）制備了一系列不同纖維濃度（3 wt%、5 wt% 和 7 wt%）的 IEMH，分別命名為 IEMH-3b、IEMH-5b 和 IEMH-7b。此外，還根據不同的均質時間（1.5 分鐘、3 分鐘和 6 分鐘）制備了一系列含有不同平均長度纖維的 5 wt% IEMH，分別命名為 IEMH5a、IEMH-5b 和 IEMH-5c。根據它們的多幅 SEM 圖像（典型圖像見圖 2a），使用 ImageJ 軟件測量了 50 根纖維的長度，從而統(tǒng)計出它們縮短纖維的平均長度。IEMH-5a、IEMH-5b 和 IEMH-5c 的數(shù)值及標準偏差分別為 109±19μm、68±11 μm 和 40±6 μm，隨著均質時間的延長而減小。如圖 2a 插入圖所示，IEMH 通常呈半透明乳液狀，至少在 6 個月內外觀不會發(fā)生任何變化，這意味著它們具有理想的分散穩(wěn)定性。它們的含水量超過 90 wt%，明顯高于已報道的 IMH，1-3,26。圖 2b 給出了所有 IEMH 在 25℃ 時的表觀粘度（ηa ）與剪切速率的函數(shù)關系。除 IEMH-7b 外，當剪切速率超過 100 s-1 時，其他 IEMH 的 ηa 均低于 0.05 Pa.s。此外，在 25 ℃ 下，所有 IEMH 的 ηa 都隨著剪切速率的增加而減小，這表明它們在環(huán)境溫度下具有假塑性。這些特性使其易于通過注射器進行注射應用，且能耗極低。為了闡明 IEMH 中縮短纖維的濃度和平均長度對其假塑性的影響，本研究使用流變學模型 Ostwald de-Waele 冪定律來擬合圖 2b 中從 0.1 s-1 到 300 s-1 的流動曲線，以確定其流動行為指數(shù)（n）。IEMH 的 n 值隨著其濃度或縮短纖維平均長度的增加而降低，這意味著其假塑性增強。這種行為可能與 IEMH 中縮短纖維之間的一些不緊密纏結有關，這些纏結在剪切力的作用下很容易解開。使用 TRIFM 觀察了不同濃度的縮短 PNA/FMPVA Janus 纖維的類似物，證明了這一推測。纖維的濃度越高，它們之間的不緊密纏結就越多?？梢酝茰y，纏結會隨著纖維平均長度的增加而增強。通過實際注射效果進一步評估了 IEMHs 的可注射性。如圖 2b 兩個插片中的一個所示，由于 IEMH-5b 具有上述低粘度和顯著的假塑性，用手就能輕松、順暢地將其從 25G 注射器針頭（內徑 260 微米）中擠出。相比之下，以前報道的 IMH 通常使用較粗的注射器針頭，如 18G（內徑 840 微米）和 22G（內徑 410 微米）。
圖2 IEMH的制備及注射性
【生理條件下 IEMH 的溶膠-凝膠轉變行為】
可注射水凝膠的溶膠-凝膠轉變行為及其轉變后的特性，尤其是在生理條件下的特性，對其生物醫(yī)學應用至關重要。本研究制備的 IEMHs 在生理條件下的溶膠-凝膠轉變行為首先是通過小瓶倒置試驗直觀觀察到的，如圖 3a所示。如上所述，在 25℃時，IEMH-5b 是一種自由流動的粘性液體（溶膠）。當溫度升高到 37 ℃ 時，它變成了能夠保持重量的固態(tài)凝膠，當溫度降回 25 ℃ 時又恢復到初始液態(tài)。這一現(xiàn)象表明，IEMH 可以隨著 25 ℃ 至 37 ℃ 之間的溫度變化發(fā)生可逆的溶膠-凝膠轉變。此外，與 IEMH-5b 濃度相同的 IEMH-5a 表現(xiàn)與 IEMH-5b 相似，而濃度相同的 IEMH-5c 也能發(fā)生溶膠-凝膠轉變，但形成的凝膠太弱，無法在倒置的小瓶中保持重量。然而，較低濃度的 IEMH-3b 無法發(fā)生溶膠-凝膠轉變，而較高濃度的 IEMH-7b 則不能完全從 37 ℃ 時的凝膠狀態(tài)恢復到 25 ℃ 時的初始液態(tài)。這些現(xiàn)象表明，IEMH 的溶膠-凝膠轉變與其說取決于其組成纖維的長度，不如說取決于其濃度。根據這些樣品以及更多樣品的小瓶反轉測試結果，得到了以纖維長度和濃度為變量的 IEMHs 溶膠凝膠相圖。從相圖中可以估算出不同纖維長度下纖維濃度的臨界值。
如圖 3b所示，本研究將 IEMHs 在室溫下通過 25G 的針頭注射到 37 ℃ 的 pH 7.4 PBS 浴中，進一步評估了 IEMHs 在生理條件下的溶膠-凝膠轉變行為及其轉變后的特性。它們瞬間失去流動性，形成穩(wěn)定的纖維狀水凝膠，表明它們的溶膠-凝膠轉變迅速發(fā)生。這一特點有利于防止它們在注入人體目標部位后流向不需要的部位。如圖 3c所示，將形成的纖維狀水凝膠在 pH 值為 7.4 的 PBS 中于 37 ℃ 下拉伸，即使拉伸到初始長度的 300% 左右，它仍能保持其完整性。這一結果表明，IEMHs 溶膠-凝膠轉變后生成的纖維狀水凝膠具有理想的彈性和堅固性。
圖3 IEMH 在生理條件下的溶膠-凝膠轉變行為及其轉變后的特性
【生理條件下IEMHs的溶膠-凝膠轉變機制】
為了深入研究所制備的IEMH在生理條件下的溶膠-凝膠轉變機理，首先采用與IEMH-5b相同的配方和工藝，使用單軸電紡絲和紫外固化的MPVA或PNA纖維或它們1:1質量比的混合物制備了三個IEMH-5b的對照樣品，分別簡稱為IEMH-m、IEMH-p和IEMH-mp。雖然這些樣品中纖維的平均長度和濃度與 IEMH-5b 相同，但只有 IEMH-p 與之表現(xiàn)相似，能在生理條件下發(fā)生溶膠-凝膠轉變，這一點已通過小瓶倒轉測試結果得到證實。這是由于 IEMH-p 中的 PNA 纖維在高于 PNA LCST 的 37 ℃ 時變得疏水，因此它們之間的疏水作用導致了樣品的溶膠-凝膠轉變，這在我們之前的出版物中已有討論。雖然 IEMH-mp 也含有 PNA 纖維，但其濃度僅為 2.5 wt%。此外，2.5 wt% 親水性 MPVA 纖維的存在可能會阻礙這些 PNA 纖維在 37℃下的疏水相互作用，從而使對照樣品無法在生理條件下發(fā)生溶膠-凝膠轉變。當溫度從 25 ℃ 升至 37 ℃ 時，MPVA 纖維的親水性應該保持不變，因此 IEMH-m 在生理條件下的表現(xiàn)與 IEMH-mp 類似，這是因為它們之間不存在疏水作用。本研究發(fā)現(xiàn)：其 G′明顯小于 IEMH-5b 在 37℃ 時的 G′，見圖 3e。此外，在振蕩頻率大于 2 rad s-1 時，IEMH-p 的 G′小于其 G″，這意味著 37℃ 時 PNA 纖維之間的疏水相互作用相對較弱。根據上述結果，本研究得出結論：除了疏水相互作用外，IEMH-5b 中的 PMVA/PNA Janus 纖維之間應該存在某種更強的相互作用，從而導致其在生理條件下發(fā)生溶膠-凝膠轉變。此外，應該是纖維的 Janus 結構導致它們產生了較強的相互作用。
傅立葉變換紅外光譜（FTIR）和核磁共振（NMR）間接證明了在生理條件下 IEMH-5b 內 PMVA/PNA Janus 纖維之間的疏水相互作用，使用 D2O 代替 pH 7.4 PBS 制備的類似物進行測試，當溫度在 25℃ 至 37℃ 之間變化時，該類似物也會發(fā)生可逆的溶膠-凝膠轉變。因此，纖維中 PNA 組分酰胺基團和 MPVA 組分羥基的活性 H 原子被 D 原子取代，從而避免了傅立葉變換紅外光譜中水的變形帶與酰胺 I 帶的重疊，如圖 4a 所示。當溫度從 25℃ 升高到 37℃ 時，酰胺 I 波段從 1622 cm-1 藍移到 1633 cm-1，而酰胺 II 波段從 1455 cm-1 紅移到 1447 cm-1。這些結果表明，PNA 成分的酰胺基團與水分子之間的氫鍵在 37 ℃ 時斷裂，導致 Janus 纖維的 PNA 側從親水性轉變?yōu)槭杷?。相比之下，分別屬于 MPVA 的 O-D 和 C-O 伸展振動的 3437 cm-1 和 1208 cm-1 波段并沒有隨著溫度的升高而發(fā)生變化。
此外，圖 4b 還給出了 IEMH-5b 類似物分別在 25 ℃ 和 37 ℃ 下測定的 1H NMR 光譜?？梢钥闯觯c在 25 ℃ 下獲得的光譜相比，在 37 ℃ 下獲得的光譜的主要變化是所有 PNA 線的綜合強度明顯下降。除了異丙基的 CH3 質子（1.21ppm）外，PNA 的其他質子信號幾乎都從光譜中消失了。這些現(xiàn)象表明，隨著溫度從 25℃ 升至 37℃，PMVA/PNA Janus 纖維的 PNA 側變得疏水，其夾帶的水分子被排出，從而使大多數(shù) PNA 單元的遷移率降低，以至于相應的線變得太寬（各質子的自旋-自旋弛豫時間 T2 太短），無法在使用液態(tài) NMR 光譜儀測量的 1H NMR 光譜中檢測到。當溫度降回 25 ℃ 時，得到的 1H NMR 圖譜與加熱前在該溫度下的圖譜沒有區(qū)別，表明 IEMH-5b 的溶膠-凝膠轉變具有可逆性。
圖4 用于研究 IEMH-5b 溶膠-凝膠轉變機制的表征結果
【IEMH 的細胞毒性】
以 IEMH-5b 為代表，本研究通過 MTT 試驗評估了 IEMH 的細胞毒性。結果表明，與 IEMH 混合的小鼠 C2C12 成肌細胞在培養(yǎng)時間（11 天）內保持存活和生長。圖 5 顯示，與對照組相比，細胞在培養(yǎng)時間內的存活率超過 95%，這反映出 IEMH 具有良好的生物相容性。眾所周知，PNIPAM 和 PVA 都是生物相容性聚合物，已被廣泛用于制備組織工程支架。因此，在 PNIPAM 鏈上引入少量 ABP 單元或在 PVA 鏈上引入甲基丙烯酸酯基團，并在紫外線照射下產生交聯(lián)結構，都不會改變它們的生物相容性。
圖5 三種培養(yǎng)時間間隔下 IEMH-5b 的 MTT 檢測結果
2. 總結與展望
總之，本研究設計并制備了一種新型可注射水凝膠，它能在生理條件下發(fā)生溶膠-凝膠轉變，形成仿 ECM 纖維結構的固體凝膠。IEMHs 由縮短的 Janus 纖維組成，能夠在體溫下自卷曲，不含任何有毒或活性化學物質。這種 Janus 纖維可以通過 s-b-s 電紡絲工藝結合紫外線照射大量制成，并使用水作為溶劑來制備紡絲溶液。傅立葉變換紅外光譜（FTIR）、核磁共振（NMR）、掃描電鏡（SEM）和 TRIFM 的表征結果表明，IEMHs 的溶膠-凝膠轉變應源于熱誘導自卷曲纖維之間的緊密纏結和纖維之間的疏水相互作用的協(xié)同作用，從而使其在生理條件下具有良好的穩(wěn)定性。在環(huán)境溫度下，它們具有顯著的有利于注射的假塑性，這種假塑性隨著纖維濃度或纖維平均長度的增加而增強。在體溫下，纖維含量僅為 5 wt%的 IEMHs 可迅速凝膠化，形成具有理想堅固性、彈性和自愈能力的固體凝膠。體外細胞毒性實驗結果表明，與 IEMH 混合的小鼠 C2C12 肌母細胞在 11 天的培養(yǎng)時間內仍能存活和生長，細胞存活率超過 95%。由于其形成的固體凝膠也具有類似于 ECM 的纖維結構，與普通的可注射分子水凝膠相比，這種新型可注射水凝膠可能具有生物效應，因此更適合用作組織工程支架。
文章來源：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2024/mh/d3mh01789c
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