氣相色譜柱作為應(yīng)用在氣相色譜儀上的核心部件之一，是樣品分離的關(guān)鍵所在，其主要通過(guò)目標(biāo)物沸點(diǎn)、極性、酸堿度等不同的理化性質(zhì)在載氣的推動(dòng)下與色譜柱固定相之間形成不同的吸附解析過(guò)程，從而使得注入分析的混合物在色譜柱上形成非均一的保留情況，按照不同的保留時(shí)間按照一定的先后順序流出，進(jìn)而達(dá)到在色譜柱上有效分離混合物的效果。
氣相色譜/質(zhì)譜技術(shù)以其高超的分離能力、化學(xué)熱穩(wěn)定性高、分析速度快、呈化學(xué)惰性等特點(diǎn)而在當(dāng)今藥物雜質(zhì)分析、中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究、石油化工成分解析等領(lǐng)域得到了廣泛而深遠(yuǎn)的應(yīng)用。
本文將從氣相色譜柱類型、固定相種類、內(nèi)徑條件、覆膜厚度、色譜柱長(zhǎng)度和其他因素等六個(gè)方面對(duì)氣相色譜柱進(jìn)行一個(gè)較為系統(tǒng)的介紹，以期能夠?yàn)閺V大分析人員提供一些思路和借鑒。
一、氣相色譜柱類型
氣相色譜柱總體可以分為填充柱和毛細(xì)管柱，這兩種類型均在分析歷史上具有重要的意義，目前市面上大多接觸的是毛細(xì)管柱，又有多少分析人還記得填充柱的裝柱手法呢？填充柱真的就是一無(wú)是處嗎？
▲圖1-常見(jiàn)的填充柱種類（圖片源自于網(wǎng)絡(luò)，侵刪）
填充柱的填料可以是多孔性粒狀系縛劑或在惰性載體顆粒表面均勻的涂敷一層很薄的固定液膜。填充柱常用內(nèi)徑2-5mm，長(zhǎng)0.5-10m的金屬管或玻璃管，其分離原理與液相色譜柱有著一定的相似性。
隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步、色譜柱商業(yè)化發(fā)展及實(shí)驗(yàn)室均一性要求的不斷提高，填充柱由于其先天特性等原因，在進(jìn)行物質(zhì)分離的過(guò)程中載氣、混合物等物質(zhì)需要在填充柱載體表面進(jìn)行充分的相互作用，從而達(dá)到擴(kuò)散、釋放，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)物質(zhì)分離，這一復(fù)雜的過(guò)程需要更加充足的時(shí)間，因此這也就導(dǎo)致了用填充柱進(jìn)行氣相色譜分析過(guò)程會(huì)時(shí)間更長(zhǎng)。且由于填充柱往往是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部自行填充，在更高分析成本的前提下，又無(wú)法使得穩(wěn)定性、均一性以及重復(fù)性等分析指標(biāo)得到到更好的保障。
此外，填充柱易受污染，因?yàn)榉蛛x過(guò)程中化合物進(jìn)入柱時(shí)可能會(huì)與填充物發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致填充物的表面不潔凈或表面積損失，造成柱效大幅度縮減，分離效果的下降。
綜合上述的種種原因，當(dāng)前分析市場(chǎng)填充柱也逐步地退出了分析人的視野。
▲圖2-常見(jiàn)的毛細(xì)管氣相色譜柱（圖片源自于網(wǎng)絡(luò)，侵刪）
毛細(xì)管色譜柱是將固定相涂在管內(nèi)壁的開口柱，其中沒(méi)有填充物。毛細(xì)管柱的內(nèi)徑在0.1至0.5mm，柱長(zhǎng)在10m到100m以上，常用的為30m，它是現(xiàn)在使用最多的一種柱型。毛細(xì)管柱從里到外依次是一層薄薄的固定相液體涂層、石英毛細(xì)管和一層聚酰胺外套這三層結(jié)構(gòu)組成，在聚酰胺這層外套的保護(hù)下能夠有效增加30m長(zhǎng)度毛細(xì)管的韌性和抗腐蝕的能力。
隨著現(xiàn)代工業(yè)能力的不斷提高，工業(yè)化自動(dòng)化生產(chǎn)毛細(xì)管柱的水平也在不斷提升，當(dāng)下各個(gè)廠家所生產(chǎn)的毛細(xì)管柱均有著不錯(cuò)的批間穩(wěn)定性，能夠有效的對(duì)分析方法實(shí)現(xiàn)重現(xiàn)而被多方機(jī)構(gòu)廣泛接受和使用。
填充柱和毛細(xì)管柱比對(duì)
1、毛細(xì)管柱柱效更高，相對(duì)于填充柱來(lái)說(shuō)，毛細(xì)管柱由于其固定液厚度相較更薄且中空的特點(diǎn)，因此在載氣流通的情況下產(chǎn)生的柱內(nèi)阻力往往會(huì)更小，因此就不存在渦流擴(kuò)散的情況，進(jìn)而能夠更為有效的縮小譜帶展寬（半峰寬）形成更好的峰形和更高的塔板數(shù)，且客觀上來(lái)說(shuō)毛細(xì)管柱一般都能夠達(dá)到30m往上的長(zhǎng)度，而填充柱往往為了達(dá)到更好的柱效會(huì)選用U型不銹鋼管（相較于螺旋型柱長(zhǎng)有所縮小），總柱長(zhǎng)往往只有3m-5m。綜合而言，填充柱的柱效遠(yuǎn)小于毛細(xì)管柱，通常30m的毛細(xì)管柱柱效輕輕松松能夠達(dá)到50000以上，而填充柱一般柱效僅要求在3000以上即可；
2、毛細(xì)管柱分離速度更快，毛細(xì)管柱的分析速度約為填充柱的數(shù)十倍。由于液膜極薄，分配比k很小，相比大，組分在固定相中的傳質(zhì)速度極快，因此有利于提高柱效和分析速度。毛細(xì)管柱能夠在一小時(shí)內(nèi)對(duì)數(shù)百種農(nóng)藥殘留進(jìn)行準(zhǔn)確分離，其對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中的目標(biāo)組分分離更為有利；
3、熔融二氧化硅毛細(xì)管色譜柱的出現(xiàn)使得毛細(xì)管色譜柱逐步取代填充柱，應(yīng)用越來(lái)越廣泛，易實(shí)現(xiàn)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，更好地實(shí)現(xiàn)微量到痕量成分的分析；
4、當(dāng)然填充柱也有著不可取代的優(yōu)勢(shì)，毛細(xì)管柱由于其較小的內(nèi)徑，不可避免的降低了自身的柱容量，其最大允許進(jìn)樣量也相應(yīng)的有所減小，因此對(duì)檢測(cè)器靈敏度就提出了更高的要求；
5、填充柱的優(yōu)點(diǎn)是柱容量大，制備方法簡(jiǎn)單，使用方便，定量分析的準(zhǔn)確度較高，在永久性氣體、低級(jí)烴類以及水分含量的測(cè)定等分析領(lǐng)域，填充柱依舊是較為關(guān)鍵的補(bǔ)充；
6、填充柱在裝填涂布過(guò)程中需要不間斷的老化，在使用過(guò)程中相較于毛細(xì)管柱對(duì)老化的要求更高（厚度一般大于5%老化能夠有效解決膜厚不均的問(wèn)題，而小于2%的膜厚由于液膜趨于單分子層分布，如果涂漬不均勻，老化亦不能使其均勻，就需要特殊的涂布手段來(lái)解決）。
在藥品分析過(guò)程中，各國(guó)藥典所收錄的分析方法均少不了氣相色譜法，其廣泛存在于藥品質(zhì)量控制、雜質(zhì)分析、殘留測(cè)定、含量測(cè)定、有關(guān)物質(zhì)檢查等環(huán)節(jié)，接下來(lái)以我們平常接觸最為廣泛的毛細(xì)色譜柱為例詳細(xì)介紹色譜柱選擇過(guò)程中的特點(diǎn)。
選擇用于分析的最佳毛細(xì)管柱是一件難以確定和非常困難的任務(wù)，掌握毛細(xì)管柱選擇理論知識(shí)對(duì)于分析工作者特別是藥物分析工作者是非常必要的，雖然沒(méi)有有關(guān)毛細(xì)管柱選擇的簡(jiǎn)易技巧、捷徑、竅門或秘訣，但卻有些理論來(lái)簡(jiǎn)化此過(guò)程，有四個(gè)要考慮的主要色譜參數(shù)：固定相、內(nèi)徑、長(zhǎng)度和液膜厚度。
▲圖3-毛細(xì)管氣相色譜柱內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖（圖片源自于Agilent大學(xué)教材，侵刪）
二、固定相種類
在進(jìn)行目標(biāo)物分析過(guò)程中對(duì)毛細(xì)管柱固定相的選擇總體傾向于遵循相似性原則，即：極性目標(biāo)物采用極性固定相，非極性目標(biāo)物采用非極性固定相，可極化物質(zhì)（芳香烴類等）采用含有苯基的DB-5/HP-5/SE-52/SE-54 柱等。
非極性分子——通常僅由 C 和 H 組成并且無(wú)偶極矩，直聯(lián)（正烷）是常見(jiàn)的非極性化合物的例子。
極性分子——主要由 C 和 H 組成同時(shí)也有其他原子，如：N、O、P、S 或鹵素。樣品包括有醇類、胺類、硫醇類、酮類、有機(jī)鹵化物等。
可極化物質(zhì)——主要由 C 和 H 組成同時(shí)包含不飽和鍵。通常有：炔和芳香族化合物。
隨著毛細(xì)管柱技術(shù)的不斷進(jìn)步，分離度并不是首要考慮的關(guān)鍵因素了，毛細(xì)管柱具有幾十萬(wàn)塊塔板，如此大的柱效率，以至于不再需要充分考慮分離問(wèn)題了。這個(gè)時(shí)候，樣品兼容性、使用溫度、穩(wěn)定性、柱流失情況等，都可能成為選擇的主要理由。
▲表1-不同固定相色譜柱比較
氣相色譜柱的分離主要是由于固定相和溶質(zhì)之間產(chǎn)生相互不同的作用力時(shí)即可達(dá)到分離的目的，其指固定相在區(qū)分兩種溶質(zhì)分子在其化學(xué)或物理性質(zhì)方面的差異能力。固定相進(jìn)行分離過(guò)程中一般存在三種作用力的共同作用，即：色散力、偶極力和氫鍵作用力。
色散力：在進(jìn)行簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)或同系物等類型物質(zhì)分離時(shí)，通過(guò)不同沸點(diǎn)進(jìn)行分離是相當(dāng)有效的，目標(biāo)物的沸點(diǎn)越低揮發(fā)性越好則其出峰就越快，保留時(shí)間相對(duì)則更短。圖4表明正構(gòu)烷烴出峰順序，隨著烷烴C數(shù)目的增加其沸點(diǎn)也相應(yīng)的增加，出峰位點(diǎn)逐步后移。
▲圖4-正構(gòu)烷烴C7-C40標(biāo)準(zhǔn)品GC-MS出峰示意圖
偶極力：當(dāng)被分析物的基本結(jié)構(gòu)或中心結(jié)構(gòu)的不同位置連接有不同的基團(tuán)，例如取代芳香烴類和鹵烴類被分析物等，氰丙基、三氟丙基和聚乙二醇類固定相都表現(xiàn)出良好的偶極作用性能。
氫鍵作用力：當(dāng)被分析物分子和固定相之間存在氫鍵作用力，固定相對(duì)于不同被分析物有著不同的氫鍵作用力，因此其能夠產(chǎn)生不同的氫鍵勢(shì)能，從而使被分析物分離。例如無(wú)氫鍵作用的DB-1較有氫鍵作用的DB-WAX對(duì)于有些被分析物分離效果就會(huì)有所降低。（圖5、圖6所示）
▲圖5-色譜柱DB-1分析某4種成分示意圖
▲圖6-色譜柱DB-WAX分析某4種成分示意圖
一般來(lái)說(shuō)，拿到一個(gè)未知雜質(zhì)等待測(cè)物質(zhì)，在不了解其理化性質(zhì)的情況下，我們通?？梢詮腄B-1的固定相進(jìn)行嘗試，按照表1中的極性順序，從非極性開始按極性漸強(qiáng)的順序選用中等極性直至高極性柱逐一嘗試，直到有較令人滿意的分析結(jié)果即可確定適用的柱極性（通常已知目標(biāo)物可通過(guò)文獻(xiàn)檢索支撐，或者是數(shù)據(jù)庫(kù)查詢到其具體的理化性質(zhì)，從而對(duì)應(yīng)的選擇適合的色譜柱）。
三、色譜柱內(nèi)徑
毛細(xì)管柱內(nèi)徑的大小對(duì)目標(biāo)物理論塔板數(shù)、分離度、保留時(shí)間、載氣流速、載樣量和進(jìn)樣口壓力等參數(shù)會(huì)產(chǎn)生直接的影響。
▲表2-柱效與柱內(nèi)徑之間的關(guān)系
（表格數(shù)據(jù)源自Agilent大學(xué)教材，侵刪）
我們通常所采用的色譜柱大多為0.25mm、0.32mm、0.53mm（一般不用于MS分析），載氣流速與毛細(xì)管柱的內(nèi)徑成正比。毛細(xì)管柱的不同內(nèi)徑均有推薦的最佳載氣流速，0.25mm（推薦0.8ml/min-1.2ml/min）、0.32mm（推薦1.5ml/min-2.5ml/min）、0.53mm（推薦3ml/min-6ml/min）該流速理論上可以使被分析物達(dá)到最佳峰形。
在同樣柱流速條件下，色譜柱的內(nèi)徑越小進(jìn)樣口EPC壓力也就越高，柱頭壓力大約是毛細(xì)管柱半徑的負(fù)二次方函數(shù)，各國(guó)藥典在色譜方法的規(guī)定中往往對(duì)色譜柱均有等效柱的要求，往往更加關(guān)注色譜柱的固定相，而對(duì)內(nèi)徑和柱流速的關(guān)注度更低，通常會(huì)由實(shí)驗(yàn)人員依據(jù)經(jīng)驗(yàn)選用合適內(nèi)徑的色譜和匹配適當(dāng)?shù)牧魉伲魉倨ヅ鋮⒄胀扑]流速）。
0.18-0.25mm的毛細(xì)管柱具有較高的理論塔板數(shù)。0.18mm的毛細(xì)管柱很適合于泵容量低的GC/MS系統(tǒng)，當(dāng)然選用0.18mm內(nèi)徑的色譜柱時(shí)需要特別關(guān)注柱體的載量，其柱容量會(huì)減少，且進(jìn)樣系統(tǒng)壓力會(huì)有更高的要求，通常MS分析也是建議采用0.25mm即可。
當(dāng)樣品載樣量有所增大時(shí)，則采用0.32mm色譜柱，其相較于0.25mm色譜柱對(duì)不分流進(jìn)樣或＞2μl進(jìn)樣體積時(shí)有著更好的柱容量，且相對(duì)短保留的目標(biāo)物能夠擁有更好的分離度。
0.53mm內(nèi)徑的色譜柱總體來(lái)說(shuō)出廠幾率還是比較少的，如果出現(xiàn)分離度不夠我一般更愿意在0.32mm的基礎(chǔ)上采用更大的膜厚來(lái)提高分離度（后文要講的），且0.32mm的內(nèi)徑已經(jīng)需要將近1.5ml/min的柱流速才能夠有效維持了，基本已經(jīng)達(dá)到了MS檢測(cè)器的上限（更高的流速對(duì)MS真空會(huì)造成一定的影響，以至于調(diào)諧不通過(guò)，島津的8050貌似實(shí)測(cè)會(huì)好一些，但總體不建議這么用，后續(xù)小伙伴們感興趣可以出一期專門講解色譜檢測(cè)器的文章哈?。虼?.25mm和0.32mm均有著不錯(cuò)的檢測(cè)器通用性，而0.53mm內(nèi)徑色譜柱大多用于高載氣流速，通常配備有頂空進(jìn)樣器的情況下會(huì)用到0.53mm內(nèi)徑色譜柱，還有一些裂解塔進(jìn)樣，頂空捕集阱聯(lián)用進(jìn)樣等等都需要更大的色譜柱內(nèi)徑。
四、色譜柱膜厚
色譜柱膜厚對(duì)我來(lái)說(shuō)最為直觀的影響可能就是保留時(shí)間和分離度的影響上了，同等內(nèi)徑和流速下，膜厚越大分離度約好，保留時(shí)間會(huì)相應(yīng)的向后有所漂移。
一般來(lái)說(shuō)，柱膜厚度與保留時(shí)間成正比，對(duì)于低沸點(diǎn)的分析物，厚度越大保留越強(qiáng)。反之柱膜較薄的毛細(xì)管柱用來(lái)減少保留能力強(qiáng)的分析物的保留時(shí)間。柱膜厚度與分離度成正比，且液膜越厚，毛細(xì)管柱的惰性越強(qiáng)，使用較厚液膜的毛細(xì)管柱可以減少或消除峰拖尾，液膜厚度與容量成正比，分析物的容量越大，其峰越寬，同時(shí)會(huì)減少分離度。而使用液膜較厚的毛細(xì)管柱會(huì)減少峰寬，增加分離度，保證較少的峰形對(duì)稱性。
說(shuō)到這不禁會(huì)有小伙伴考慮是否應(yīng)該都采用厚膜色譜柱來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)了？當(dāng)然不行！色譜柱并不是柱膜越厚越好！柱膜越厚毛細(xì)管柱的流失水平越高，其對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)相應(yīng)的產(chǎn)生干擾也會(huì)越多，方法開發(fā)難度也會(huì)有所提升。當(dāng)柱膜厚度增加時(shí)，保留時(shí)間較大的組分可能轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管柱流失較高的區(qū)域，而難以被識(shí)別到，由于流失嚴(yán)重，因此液膜厚度與耐受溫度成反比，膜厚越大的色譜柱其程序升溫最高耐受溫度也會(huì)相應(yīng)的有所降低。
▲表3-不同膜厚和內(nèi)徑色譜柱的載樣量示意圖
（表格數(shù)據(jù)源自Agilent大學(xué)教材，侵刪）
五、色譜柱長(zhǎng)度
一般來(lái)說(shuō)日常常規(guī)檢驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中毛細(xì)管氣相色譜柱常用長(zhǎng)度為30m，但某些時(shí)候進(jìn)行方法開發(fā)或者是特殊組分分析的時(shí)候還會(huì)采用到不同長(zhǎng)度的色譜柱，且不同公司的色譜柱均具有著不同的偏好，就比如在脂肪酸組分分析的過(guò)程中常規(guī)少量組分的分析采用30m長(zhǎng)度的WAX色譜柱即可勝任，而多種復(fù)雜的組分往往會(huì)選用不同品牌的專用色譜柱，例如：Thermo的TG-FAME色譜柱和迪馬的DM-2560色譜柱，雖然這兩根色譜柱均能夠有效的進(jìn)行脂肪酸甲酯的檢測(cè)，但往往在選用過(guò)程中TG-FAME一般常用的是50m的，而DM-2560由于中國(guó)藥典——0713 脂肪與脂肪油測(cè)定法中有所推薦“聚二氰丙基硅氧烷（或極性相近）為固定液的毛細(xì)管色譜柱（100m×0.25mm，0.2μm）”因此通常會(huì)選用100m長(zhǎng)度的色譜柱。
在實(shí)驗(yàn)分析過(guò)程中選用不同長(zhǎng)度的毛細(xì)管柱其對(duì)柱效、分離度、保留時(shí)間、載氣壓力亦是有著不同程度的影響。
▲圖7-標(biāo)準(zhǔn)品37種脂肪酸成分示意圖（TG-FAME柱）
▲圖8-標(biāo)準(zhǔn)品37種脂肪酸成分示意圖（DM-2560柱）
一般認(rèn)為理論塔板數(shù)與柱子長(zhǎng)度成正比，分離度與理論板數(shù)的平方根成正比，增加柱子長(zhǎng)度理論上是可以增加理論塔板數(shù)和分離度。要想得到窄峰和較高的柱效可以考慮使用較長(zhǎng)的毛細(xì)管柱，保留時(shí)間與毛細(xì)管柱的長(zhǎng)度成反比，使用較長(zhǎng)的毛細(xì)管柱會(huì)增加被分析物的保留時(shí)間。通過(guò)圖7、圖8的比對(duì)能夠更為直觀的看到DM-2560柱（100m）的色譜柱其出峰時(shí)間總體相較于TG-FAME柱（50m）略微后移，分離度總體來(lái)看長(zhǎng)柱子的峰相較于短柱峰沒(méi)有那么集中。
六、小結(jié)
在氣相色譜柱的選擇過(guò)程中綜合考慮過(guò)上述因素后，本著精益求精的精神，我們往往還會(huì)考慮色譜柱的最高使用溫度和程序升溫最高耐受、最低操作溫度（部分色譜柱有0℃或者-20℃）、不同品牌不同系列色譜柱的差異性（CD、TG、DB、HP、VF等）。
當(dāng)下藥物復(fù)雜程度在不斷升級(jí)，這便給我們分析人提出了更高的基質(zhì)效應(yīng)的挑戰(zhàn)！因此在目標(biāo)物分析過(guò)程中如何保證準(zhǔn)確度和精密度的可靠性便成為了核心考慮的問(wèn)題，色譜柱選得好回收率沒(méi)煩惱！不同的毛細(xì)管柱之間的保留行為有著極大的差異性，選擇合適的毛細(xì)管柱是利用氣相色譜進(jìn)行藥物分析工作的重點(diǎn)！
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
