全氟化合物(PFCs)是一類(lèi)烷基上氫原子全部被氟原子取代的人工合成化合物，因具有獨(dú)特的疏水疏油性、耐熱性及高表面活性等理化性質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于紡織、滅火劑、殺蟲(chóng)劑等領(lǐng)域。隨著PFCs規(guī)?；a(chǎn)和使用，大量的PFCs被排放到環(huán)境中。由于PFCs具有持久性、生物積累性，難以光解、水解和被生物降解，潛在毒性以及長(zhǎng)距離遷移等特性，從而導(dǎo)致環(huán)境介質(zhì)、生物體和食品中普遍檢出PFCs。研究表明，PFCs可通過(guò)食物鏈逐級(jí)放大并蓄積在人或動(dòng)物體內(nèi)，從而產(chǎn)生多種毒性效應(yīng)，甚至導(dǎo)致器官衰竭或癌變。因此，PFCs污染已成為全球性問(wèn)題,對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成潛在威脅。近年來(lái)，為了降低PFCs的健康風(fēng)險(xiǎn)，各國(guó)政府和行業(yè)逐漸重視PFCs的源頭管控，逐步減少、限制含PFCs原料的生產(chǎn)、貿(mào)易和使用，逐步加強(qiáng)食品接觸材料在內(nèi)的產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)管控。2020年歐洲食品安全局建議全氟辛酸 (PFOA)、全氟壬酸 (PFNA)、全氟己烷磺酸(PFHxS)和全氟辛烷磺酸(PFOS)等4 種PFCs的每周允許攝入量為8ng·kg-1 (根據(jù)體重計(jì)算)，但是世界各國(guó)沒(méi)有明確食品中PFCs的限量要求，僅提示關(guān)注 PFCs的使用和風(fēng)險(xiǎn)管控。膳食暴露被學(xué)術(shù)界公認(rèn)為是非職業(yè)暴露人群暴露PFCs的主要原因，高蛋白類(lèi)食物是膳食暴露PFCs的重要來(lái)源。雞蛋作為百姓日常膳食中最主要的動(dòng)物源性蛋白之一，其食用安全不容忽視，但PFCs通常為痕量水平，因此開(kāi)發(fā)雞蛋中PFCs的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
PFCs帶有極性基團(tuán)，沸點(diǎn)較高，難揮發(fā)，若使用氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)則需要衍生化前處理，操作繁瑣；而且PFCs分子結(jié)構(gòu)中沒(méi)有紫外吸收基團(tuán)或熒光發(fā)射基團(tuán)，不能直接利用液相色譜-紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、抗干擾性強(qiáng)等特點(diǎn)，結(jié)合不同類(lèi)型樣品前處理手段成為PFCs的主流分析方法。目前，PFCs前處理主要采用酸、堿或離子對(duì)試劑使其離子化后，用混合型弱陰離子交換固相萃取小柱(WAX柱)凈化，此過(guò)程操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng),且容易堵塞凈化柱。因此，本工作采用乙腈溶液振蕩和超聲提取后，使用濾過(guò)型CaptiveEMR-Lipid柱凈化，提出了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中全氟丁酸(PFBA)、全氟戊酸 (PFPeA)、全 氟 己 酸 (PFHxA)、全 氟 庚 酸(PFHpA)、PFOA、PFNA、全氟癸酸(PFDA)、全氟十一酸(PFUnDA)、全氟十二酸(PFDoDA)、全氟十三酸(PFTrDA)、全氟十四酸 (PFTeDA)以及全氟丁烷磺酸 (PFBS)、PFHxS、全氟庚烷磺酸(PFHpS)、PFOS等15種PFCs含量的方法。
1、 試驗(yàn)方法
雞蛋樣品采集于超市，每份采集10個(gè)。將雞蛋去殼后，攪拌均勻，置于聚丙烯塑料離心管中，于-20℃保存?zhèn)溆?。檢測(cè)前，將樣品恢復(fù)至室溫，搖勻。稱(chēng)取2g于聚丙烯離心管中，加入0.1mL20.0μg·L-1混合內(nèi)標(biāo)溶液、10mL80% (體積分?jǐn)?shù)，下同 )乙腈溶液，振蕩10min，超聲15min后，于4℃離心5min。分取5mL濾液(樣品提取液)，直接過(guò)Captive EMR-Lipid柱，收集流出液于聚丙烯離心管中，于60℃水浴氮吹至近干，加入500μL甲醇，渦旋混勻，離心5min，取上清液，按照儀器工作條件測(cè)定。
2、 結(jié)果與討論
1.質(zhì)譜條件的優(yōu)化
PFCs中的氫原子被氟原子取代，且 含有羧基和磺酸基，是酸性化合物，在 ESI源中易形成[M-H]-離子，常采用 ESI-模式進(jìn)行檢測(cè)。將50.0μg·L-1的 PFCs混合標(biāo)溶液和混合內(nèi)標(biāo)溶液以8μL·min-1的流量注入質(zhì)譜儀進(jìn)行全掃描，優(yōu)化去簇電壓、霧化氣壓力等參數(shù)；然后對(duì)[M-H]-母離子進(jìn)行碰碎。結(jié)果表明，羧酸型PFCs易發(fā)生中性丟失CO2產(chǎn)生[M-H-44]-子離子，磺酸型 PFCs易斷裂生成[FSO3]-和[SO3]-子離子。分別選擇響應(yīng)值高、穩(wěn)定且無(wú)干擾的[M-H-44]-和[FSO3]-為定量離子。
2.色譜條件的優(yōu)化
PFCs既有疏水性，又有親水性，多采用較低硅羥基活性填料的C18反相色譜柱實(shí)現(xiàn)分離。試驗(yàn)分別考察了 Agilent Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱、Thermo Hypersil Gold色譜柱、Acquity Waters BEH C18色譜柱對(duì)15種PFCs分離效果的影響。結(jié)果表明，在相同梯度洗脫程序下，PFBA在 Agilent Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱上有較好的保留，且其余目標(biāo)物的分離效果較佳。因PFCs具有羧酸或磺酸官能團(tuán)，具有一定極性，在流動(dòng)相中加入適量乙酸銨可提高目標(biāo)物的離子化效率，減少溶劑效應(yīng)，改善峰形。
選用Agilent Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱作為分析柱，考察了 PFCs在2，5，10mmol·L-1乙酸銨溶液中的分離及響應(yīng)情況。結(jié)果表明：隨著乙酸銨溶液濃度的增加，PFCs在色譜柱上的保留增強(qiáng)，出峰時(shí)間延遲,但組分間分離度無(wú)顯著變化；乙酸銨溶液濃度對(duì)磺酸型PFCs的響應(yīng)值影響不顯著，而羧酸型PFCs的響應(yīng)值隨著乙酸銨溶液濃度的增加有所下降。因此，試驗(yàn)采用2mmol·L-1乙酸銨溶液進(jìn)行梯度洗脫。
在優(yōu)化的色譜、質(zhì)譜條件下，15 種PFCs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。
圖1 總離子流色譜圖
3.提取溶劑的優(yōu)化
試驗(yàn)選擇穿透力強(qiáng)、蛋白沉淀效果好的乙腈作為有機(jī)提取溶劑，考察了體積分?jǐn)?shù)分別為70%，80%，90%的乙腈溶液對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。結(jié)果表明，15種目標(biāo)物回收率分別為76.5%~119%，78.0%~111%，75.3% ~108%均在痕量分析合理的回收率范圍內(nèi)，但是加水量過(guò)多，蛋白沉淀效果變差，提取液中水溶性成分含量增加，基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，影響后續(xù)的凈化效果,延長(zhǎng)凈化液的氮吹時(shí)間。因此，試驗(yàn)選擇以80%乙腈溶液提取目標(biāo)物。
4.凈化柱的優(yōu)化
雞蛋基質(zhì)復(fù)雜，含有大量蛋白質(zhì)、卵黃素、膽固醇等內(nèi)源性物質(zhì)，需要選擇合適的凈化方法來(lái)降低基質(zhì)干擾。濾過(guò)型Captive EMR-Lipid柱可利用排阻和疏水相互作用機(jī)制高效去除雞蛋樣品中脂質(zhì)等基質(zhì)。通過(guò)低、中、高等3個(gè)濃度水平的基質(zhì)加標(biāo)回收試驗(yàn)，樣品提取液經(jīng)濾過(guò)式CaptiveEMR-Lipid柱凈化后，15種目標(biāo)物的回收率為78.0%~111%，而采用堿性離子對(duì)試 劑 提 取，WAX柱凈化后，PFTrDA、PFTeDA等長(zhǎng)鏈PFCs的回收率均小于50.0%，且凈化過(guò)程中易出現(xiàn)WAX柱堵塞的現(xiàn)象。因此，試驗(yàn)選擇以濾過(guò)型 Captive EMR-Lipid柱凈化，從而減少傳統(tǒng)固相萃取柱活化、淋洗等步驟，操作更加簡(jiǎn)單、快速，并且長(zhǎng)碳鏈 PFCs的回收率得到了顯著改善。
5.基質(zhì)效應(yīng)
食品中的內(nèi)源性成分及樣品前處理過(guò)程中的外源性成分會(huì)影響目標(biāo)物的離子化效率，由此可能產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)(ME)。根據(jù)(1-目標(biāo)物在雞蛋基質(zhì)提取液中的峰面積/目標(biāo)物在溶劑甲醇中的峰面積)×100%計(jì)算ME值。當(dāng)ME絕對(duì)值為0~20.0%時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)；當(dāng)ME絕對(duì)值為20.0%~50.0%時(shí)，表明存在弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME絕對(duì)值大于50.0%時(shí)，表明存在強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。15種PFCs的ME值見(jiàn)表1。
表1 基質(zhì)效應(yīng)
由表1可知：使用濾過(guò)型 Captive EMR-Lipid柱凈化后，15種目標(biāo)物的 ME絕對(duì)值均不大于50.0%，絕大部分目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)，但 PFHxA、PFNA、PFOS的ME絕對(duì)值為20.0%~50.0%，表明存在弱基質(zhì)效應(yīng)。因此，試驗(yàn)選擇采用同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，以降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)PFCs的影響，提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確度。
6.標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定下限
用甲醇將15種PFCs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為0，0.125，0.250，0.500，1.00，2.00，4.00，8.00，12.0，16.0，20.0μg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，同時(shí)加入適量的同位素混合內(nèi)標(biāo)溶液，使內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為2.00μg·L-1，按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。以目標(biāo)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，15種 PFCs 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍均為0.125~20.0μg·L-1，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。
表2 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和測(cè)定下限
以10倍信噪比(S/N)計(jì)算測(cè)定下限(10S/N)，結(jié)果見(jiàn)表2。
目前，我國(guó)發(fā)布的食品中PFCs檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)主要包括GB 5009.253-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物源性食品中全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)的測(cè)定》、SN/T 3544-2013《出口食品中全氟辛酸和全氟辛烷磺酸鹽的測(cè)定》、SN/T 4588-2016《出口蔬菜、水果中多種全氟烷基化合物測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》、SN/T 5222-2019《蜂蜜中20種全氟烷基化 合物的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定下限為0.01~1μg·kg-1，與之相比，本方法測(cè)定下限為0.05~0.16μg·kg-1，滿足痕量分析的基本要求。
7.精密度和回收試驗(yàn)
在空白雞蛋樣品中加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使15種PFCs加標(biāo)量為0.500，4.00，16.0μg·kg-1，渦旋混勻，放置過(guò)夜，使樣品基質(zhì)與目標(biāo)物充分接觸，然后按照試驗(yàn)方法進(jìn)行處理及測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)濃度水平測(cè)定6份平行樣，計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
結(jié)果顯示，15種PFCs的回收率為 78.0%~111%，測(cè)定值的RSD為0.87%~14%，回收率和精密度均滿足實(shí)際樣品的分析要求。
8.樣品分析
按照試驗(yàn)方法對(duì)10份市售雞蛋樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：有6份樣品檢出 PFCs，檢出的PFCs有PFPeA、PFHxA、PFHpA、PFOA、PFNA、PFDA、PFUnDA、PFDoDA、PFTeDA、PFOS，檢出量為0.045~0.670μg·kg-1，且PFOA、PFOS的檢出率高達(dá)60%，其余PFBA、PFTrDA、PFBS、PFHxS、PFHpS均未檢出。
3、 論文總結(jié)
本工作提出了濾過(guò)型固相萃取柱凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中15種PFCs含量的方法，該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)，為開(kāi)展雞蛋中PFCs的檢測(cè)提供了方法參考。
作者：吳坤1，吳玉田1，趙君1，周貽兵2
單位：1.貴州師范學(xué)院 化學(xué)與材料學(xué)院；
2.貴州省疾病預(yù)防控制中心 實(shí)驗(yàn)中心
來(lái)源：《理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)》2024年第1期
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
