近期，浙江大學(xué)高分子系高長有教授和浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院葉娟教授在科愛出版社的Bioactive Materials期刊上聯(lián)合發(fā)表研究論文：一種兼具強(qiáng)韌性、抗菌和抗氧化能力的水凝膠敷料（PAHT），通過抵抗感染和減輕氧化應(yīng)激促進(jìn)傷口愈合并降低瘢痕（HSs）形成。
增生性瘢痕（HSs）通常出現(xiàn)在深部皮膚損傷后，給患者的生活造成了極大的不便。HSs的產(chǎn)生和發(fā)展與傷口愈合過程密切相關(guān)，當(dāng)炎癥階段持續(xù)或傷口愈合延遲時，就會導(dǎo)致HSs等病理性瘢痕的出現(xiàn)。本質(zhì)上講，HSs是網(wǎng)狀真皮的炎癥性疾病，其特征是炎癥反應(yīng)延長、血管生成過度以及肌成纖維細(xì)胞和膠原蛋白的過度積累。細(xì)菌感染和氧化應(yīng)激是導(dǎo)致炎癥的兩個典型因素。目前針對HSs的敷料研究往往忽視了細(xì)菌感染的潛在影響?？紤]到細(xì)菌感染的多發(fā)性和廣泛性，有必要明確感染情況下HSs的預(yù)防和治療。
在此，該研究提出了一種強(qiáng)韌水凝膠敷料，以促進(jìn)感染傷口的愈合并控制瘢痕的形成。水凝膠基質(zhì)由聚乙烯醇（PVA）和瓊脂糖的雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)構(gòu)成，為水凝膠的力學(xué)性能提供強(qiáng)力支撐，并負(fù)載超支化聚賴氨酸（HBPL）和單寧酸（TA）賦予水凝膠具備抗菌和抗氧化能力（圖1）。
圖1 抗菌和抗氧化水凝膠敷料加速感染傷口愈合、減少增生性瘢痕的形成。
一、水凝膠的制備與表征
制備了五種類型的水凝膠敷料（表1）。以PAHT水凝膠為例，制備方法如下：在110 ℃下，機(jī)械攪拌下將20 wt% PVA1799和2 wt%瓊脂糖溶解在76.2 wt%水中；冷卻至90 ℃后，加入1 wt% HBPL（博慧（浙江）生物技術(shù)有限責(zé)任公司）和0.8 wt% TA，調(diào)節(jié)pH至6；完全溶解后，將溶液澆鑄到模具中，并冷卻至室溫，然后將其在-20 ℃下冷凍4小時，并在室溫下解凍1小時，此過程重復(fù)3次。其他水凝膠按照類似的過程制備。
表1 本研究制得的各水凝膠簡稱及組成
合格的水凝膠敷料應(yīng)具有足夠強(qiáng)韌的力學(xué)性能。與單網(wǎng)絡(luò)PVA水凝膠相比，所有雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的抗拉性均有顯著提高。HBPL的添加實現(xiàn)了較大程度的增強(qiáng)，而TA的效果較小。當(dāng)HBPL和TA同時存在時，拉伸模量最大，而斷裂伸長率和斷裂強(qiáng)度略有下降，表明它們的增強(qiáng)效果似乎具有拮抗作用（圖2A-E）。在壓縮測試中，所有水凝膠都沒有破碎，只產(chǎn)生了少量的塑性變形；所有雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的抗壓性均高于單網(wǎng)絡(luò)水凝膠（圖2F-H）。PAHT水凝膠具有良好的耐疲勞性能，在20次循環(huán)拉伸和壓縮測試中未觀察到明顯的塑性變形，滯后環(huán)?。▓D2I, J）。這些結(jié)果證明，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠PAHT表現(xiàn)出良好的力學(xué)性能，在應(yīng)用中不會破裂或失效。
圖2 水凝膠的機(jī)械性能。（A）不同組分水凝膠的拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線。（B）PAHT水凝膠拉伸試驗照片。（C）不同水凝膠的拉伸模量、（D）斷裂伸長率和（E）斷裂強(qiáng)度。（F）不同組分水凝膠的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線。（G）PAHT水凝膠壓縮試驗照片。（H）不同水凝膠的壓縮模量。PAHT水凝膠的循環(huán)拉伸（I）和壓縮（J）曲線。
水凝膠敷料通常設(shè)計用于吸收傷口環(huán)境中的滲出物。然而，過度吸水會導(dǎo)致水凝膠體積的極度膨脹和力學(xué)性能的急劇下降，不利于其對傷口的持續(xù)保護(hù)。PAHT水凝膠具有良好的抗溶脹性，且溶脹平衡后仍然保留足夠大的力學(xué)性能（圖3A, B）。另一方面，水凝膠敷料可以為傷口愈合提供有利的濕環(huán)境。當(dāng)未施加保護(hù)膜時，PAHT水凝膠所含的水分快速流失（圖3C）。然而，在實際應(yīng)用中，傷口敷料通常覆蓋有一層保護(hù)膜，可以抵抗污染并保持水分。因此失水率將大大降低，不會影響水凝膠應(yīng)用。
水凝膠中的功能組分HBPL和TA是通過物理作用負(fù)載的，可以在傷口環(huán)境中釋放。當(dāng)HBPL和TA單獨(dú)存在時，可實現(xiàn)快速釋放；當(dāng)HBPL和TA共存時，由于二者之間的靜電相互作用以及TA與水凝膠基質(zhì)分子間的氫鍵作用，釋放速率減緩（圖3D, E）。值得一提的是，在體內(nèi)應(yīng)用中，由于液體量更少，HBPL和TA的釋放速度要慢得多，因此預(yù)計功能性會更持久。
圖3 水凝膠的理化和生物學(xué)性質(zhì)。（A）PAHT水凝膠的溶脹能力和（B）溶脹后的拉伸性能。（C）PAHT水凝膠的保濕能力。（D）HBPL和（E）TA的累積釋放。水凝膠對（F）DPPH、（G）·OH、（H）·O2−和（I）H2O2的清除效果。與水凝膠孵育后（J）MRSA和大腸桿菌菌落的照片，以及（K，L）相應(yīng)抗菌率的定量計算。水凝膠的（M）細(xì)胞和（N）血液相容性。
二、水凝膠的抗氧化能力、抗菌能力和生物相容性
減輕傷口的氧化應(yīng)激對于減少隨后的瘢痕形成至關(guān)重要。由于TA優(yōu)異的抗氧化能力，含有TA的PAT和PAHT水凝膠對DPPH、·OH、·O2−和H2O2具有高效的清除效果，HBPL中氨基的還原性也貢獻(xiàn)了部分抗氧化能力（圖3F-I）。
細(xì)菌感染是傷口炎癥的重要原因，阻礙傷口愈合并加重瘢痕形成。分別以MRSA和大腸桿菌作為革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌為代表進(jìn)行測試。PA水凝膠沒有抗菌效果，由于TA的存在PAT水凝膠具有一定抗菌能力，而加入HBPL的PAH和PAHT水凝膠可以殺死幾乎所有細(xì)菌（圖3J-L），表明HBPL的高效抗菌性能。HBPL的抗菌性主要來源于其豐富的氨基通過靜電作用對細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞。
傷口敷料必須安全無害。因此，分析了水凝膠的細(xì)胞相容性和血液相容性，均呈現(xiàn)出良好的安全性（圖3M, N）。
三、水凝膠促進(jìn)感染傷口愈合的效果
為評價PAHT水凝膠敷料治療體內(nèi)創(chuàng)面的效果，建立了MRSA感染的全層皮膚缺損大鼠模型（圖4A）。含HBPL的水凝膠抗感染能力十分突出，PAHT組愈合最快，12天時傷口幾乎完全閉合（圖4B-D）。從收集的傷口組織中分離出細(xì)菌，分析各組的體內(nèi)抗感染能力。與宏觀觀察結(jié)果一致，對照組和PA組的傷口中存在大量細(xì)菌，PAT組的細(xì)菌數(shù)量減少，而PAH和PAHT組的細(xì)菌含量最低（圖4E, F）。
圖4 水凝膠促進(jìn)MRSA感染的傷口愈合效果。（A）傷口愈合實驗方案。（B）不同時期用不同水凝膠治療的感染傷口的代表性圖像。（C）傷口愈合過程動態(tài)圖，以及（D）傷口面積的定量分析。（E）不同水凝膠治療后傷口中MRSA含量的定量計算，以及（F）相應(yīng)的菌落照片。
ELISA結(jié)果顯示，促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)在所有治療組中均下調(diào)，其中抗菌和抗氧化功能最強(qiáng)的PAHT組下調(diào)最為顯著（圖5A–C）。相應(yīng)地，抗炎因子IL-4和IL-10在所有治療組中均上調(diào)，尤其是PAHT組（圖5D, E）。這些結(jié)果表明PAHT水凝膠在體內(nèi)抗炎方面具有顯著的功效。
通過病理染色對傷口愈合進(jìn)行更詳細(xì)的分析標(biāo)明，在整個愈合過程中，PAHT組的炎癥浸潤最輕，組織再生和膠原沉積最好（圖5F）。眾所周知，血管生成在傷口愈合中起著重要作用，而CD31可以代表新血管的形成。免疫組化染色和相應(yīng)的定量分析結(jié)果表明，PAHT水凝膠治療顯著提高了CD31的表達(dá)（圖5G, H）。這些結(jié)果表明，抗菌和抗氧化敷料在加速傷口閉合和表皮再生、促進(jìn)膠原沉積和血管生成方面具有很強(qiáng)的積極作用，從而為皮膚傷口恢復(fù)提供了有力的支持。
圖5 大鼠傷口組織的ELISA和組織學(xué)分析。傷口中（A）TNF-α、（B）IL-1β、（C）IL-6、（D）IL-4和（E）IL-10炎癥因子的表達(dá)水平。（F）傷口愈合過程中的H&E和Masson染色。（G）第12天傷口組織的CD31免疫組織化學(xué)染色，以及（H）定量分析。
四、水凝膠抑制增生性瘢痕形成的效果
建立了兔耳增生性瘢痕模型（圖6A）。前4周的創(chuàng)面愈合階段與大鼠模型結(jié)果基本一致。在第4周結(jié)束時，在對照、PA和PAT組中觀察到明顯的紅色瘢痕。之后，瘢痕逐漸穩(wěn)定，隨著時間的延長顏色逐漸減退。在所有組中，PAH組和PAHT組的瘢痕外觀最接近正常皮膚（圖6B）。
圖6 水凝膠抑制MRSA感染傷口的增生性瘢痕形成的效果。（A）增生性瘢痕實驗方案。（B）在不同時期用不同水凝膠治療的傷口閉合和隨后的瘢痕形成和穩(wěn)定的代表性圖像。
H&E染色（圖7A）顯示隨著水凝膠功能的增多，HSs厚度逐漸減小，瘢痕抬高指數(shù)（SEI）顯示出相同的趨勢（圖7B, C）。HSs的形成與膠原蛋白的過度沉積密切相關(guān)。Masson染色計算的膠原體積分?jǐn)?shù)（CVF）表明，經(jīng)水凝膠治療后，膠原蛋白的過度沉積受到明顯抑制（圖7D）。膠原纖維的類型對皮膚形態(tài)至關(guān)重要，通過偏振光顯微鏡觀察天亮星紅染色樣品，發(fā)現(xiàn)對照組中幾乎沒有III型膠原蛋白；用功能性水凝膠治療后，III型膠原蛋白的比例增加。此外，肌成纖維細(xì)胞的過度活動會導(dǎo)致HSs形成和進(jìn)一步的攣縮。α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）作為成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物，在HSs中特異性過表達(dá)。免疫熒光染色顯示對照組中α-SMA表達(dá)尤為明顯；隨著水凝膠功能的增多，α-SMA的表達(dá)逐漸降低，PAHT組的狀態(tài)最接近正常皮膚?？傊琍AHT水凝膠可發(fā)揮顯著抑制HSs生成的作用。
圖7 兔耳瘢痕組織的組織學(xué)分析。（A）各組的H&E染色、Masson染色、天狼星紅染色（偏振光顯微鏡觀察）和α-SMA免疫熒光染色。H&E染色中（B）瘢痕厚度和（C）瘢痕抬高指數(shù)（SEI）以及Masson染色中（D）膠原體積分?jǐn)?shù)（CVF）的定量分析。
進(jìn)行RNA測序探討PAHT水凝膠加速感染傷口愈合和抑制HSs生成的潛在機(jī)制。正常組、對照組和PAHT三組的主成分分析顯示轉(zhuǎn)錄組譜存在顯著差異（圖8A）。火山圖顯示出對照組與正常組、PAHT和對照組的差異基因數(shù)量（圖8B, C）。基因熱圖顯示，與正常組相比，與免疫和炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因在對照組中顯著上調(diào)；經(jīng)PAHT水凝膠治療后，這些基因的表達(dá)恢復(fù)到接近正常組的水平（圖8D）。對對照組與正常組上調(diào)、PAHT和對照組下調(diào)的基因取交集，并利用KEGG分析潛在的信號通路，發(fā)現(xiàn)差異基因顯著參與與宿主防御、免疫調(diào)節(jié)和炎癥通路相關(guān)的信號通路（圖8E）。綜上，PAHT水凝膠促進(jìn)傷口修復(fù)并減少HSs形成的機(jī)理是減少感染和控制炎癥。
圖8 PAHT水凝膠抑制增生性瘢痕形成的機(jī)理分析。（A）正常組、對照組和PAHT三組的主成分分析。（B）對照組與正常組和（C）PAHT與對照組的差異基因火山圖。（D）差異基因熱圖。（E）對照組與正常組中上調(diào)、PAHT與對照組中下調(diào)交集基因的KEGG通路分析。
五、總結(jié)
過PVA和瓊脂糖構(gòu)建雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，加入HBPL和TA制備了PAHT水凝膠，具有抗菌、抗氧化功能，能夠促進(jìn)傷口愈合并抑制后續(xù)HSs生成。水凝膠的制備工藝簡單易重復(fù)，相關(guān)原料安全、價格低廉、應(yīng)用廣泛。通過力學(xué)實驗驗證了其優(yōu)異的強(qiáng)度、韌性和抗疲勞性能，證明了雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的有效性。該水凝膠能夠快速去除ROS，并對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均表現(xiàn)出有效的殺滅能力。在大鼠傷口模型中，PAHT水凝膠顯示出促進(jìn)傷口愈合、殺死體內(nèi)細(xì)菌、減少炎癥和促進(jìn)組織再生的能力。在兔耳瘢痕模型中，PAHT水凝膠對抑制HSs形成有顯著影響。具體而言，PAHT水凝膠能夠減少瘢痕厚度，減少膠原沉積，調(diào)節(jié)膠原纖維類型并下調(diào)α-SMA的產(chǎn)生。RNA測序表明，PAHT水凝膠的良好效果主要源于其有效抵抗MRSA從而緩解炎癥反應(yīng)的能力。綜上所述，PAHT水凝膠具有廣闊的轉(zhuǎn)化前景，將在感染創(chuàng)面的抗瘢痕形成領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用。
原文信息
Xiaoqing Liu1, Yiming Sun1, Jie Wang, Yongyuan Kang, Zhaolong Wang, Wangbei Cao, Juan Ye*, Changyou Gao*.
A tough, antibacterial and antioxidant hydrogel dressing accelerates wound healing and suppresses hypertrophic scar formation in infected wounds.
Bioactive Materials, 34 (2024) 269-298. DOI: 10.1016/j.bioactmat.2023.12.019.
京公網(wǎng)安備11010802046783號
