介紹
膿毒癥（sepsis）是一種由感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙，常常會導(dǎo)致多器官功能障礙，危及生命，是重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）死亡的罪魁禍?zhǔn)?。新興的可穿戴技術(shù)為持續(xù)和同時監(jiān)測人體表皮上的各種生物標(biāo)志物提供變革性技術(shù)。近日，復(fù)旦大學(xué)孔繼烈，方雪恩在“Nature Communications”發(fā)文：Long-term monitoring of ultratrace nucleic acids using tetrahedral nanostructure-based NgAgo on wearable microneedles2。作者報告了一種基于四面體納米結(jié)構(gòu)的格氏嗜鹽堿桿菌Argonaute（NgAgo），用于在可穿戴設(shè)備上長期穩(wěn)定監(jiān)測體內(nèi)敗血癥的超痕量未擴(kuò)增核酸（無細(xì)胞DNA和RNA）。這款集成的無線可穿戴設(shè)備由柔性電路板、微針生物傳感器和具有富集能力的可拉伸表皮貼片組成。體內(nèi)實驗表明，它適合于細(xì)胞游離DNA和RNA的實時監(jiān)測，靈敏度為0.3 fM，最長可達(dá)14天。這些結(jié)果為體內(nèi)高靈敏度的分子識別和體內(nèi)核酸檢測提供了一種策略。
圖1詳細(xì)介紹了可穿戴電子系統(tǒng)，該系統(tǒng)可在一段時間內(nèi)（兩周以上）內(nèi)以高靈敏度連續(xù)記錄未擴(kuò)增的目標(biāo)核酸的變化。如圖1a所示，該集成的可穿戴系統(tǒng)由一次性微針貼片和可重復(fù)使用的電子器件（無線柔性電路板、功能性熱塑性聚氨酯薄膜）組成。在本研究中，一次性微針（MN）貼片是由三電極陣列以一種緊湊的方式制成的，即三合一貼片。然后，通過噴霧印刷和鑄造技術(shù)制備了由第一層銀和第二層碳納米管組成的功能性熱塑性聚氨酯（TPU）。帶有陽極和陰極的功能化TPU薄膜分別與無線柔性電路板（FCB）連接，它能夠通過反向離子電泳富集核酸。集成的可穿戴系統(tǒng)的第三部分是自行設(shè)計和定制的FCB，用于電源和信號管理。
圖1b顯示了MN界面結(jié)構(gòu)的示意圖。TDN-17被用作固定在石墨烯表面上的最佳納米支架。在本研究中，系統(tǒng)靈敏度的提高可能來自TDN的空間取向，如圖1c所示。TDN的剛性和分子水平的介導(dǎo)使ISF中的超痕量生物傳感成為可能，這在很大程度上涉及雙電層高度的增加。在TDN-17上，作為原核Argonautes之一的NgAgo蛋白被固定以形成NgAgo/引導(dǎo)DNA復(fù)合物，表示為NgAgo-gDNA。在gDNA（24-bp 5′-磷酸化單鏈DNA）的引導(dǎo)下，通過Watson-Crick堿基配對搜索整個靶序列。一旦匹配，固定的NgAgo-gDNA可以與靶核酸結(jié)合，由于候選gDNA的存在，靶核酸是明確確定的穩(wěn)定的。
本研究從三個方面對MN進(jìn)行了改進(jìn)：
（I）利用SU-8光刻膠作為疏水、剛性、非膨脹性的材料，通過光刻法制備MN，這對于構(gòu)建高性能的生物傳感界面具有重要意義；
（II）作為納米支架，TDN參與生物傳感界面以產(chǎn)生增強(qiáng)的信號輸出;
（III）NgAgo-gDNA錨定在TDN的頂部，形成TDN-NgAgo-gDNA（表示為TDN-Ng），由于使用gDNA，這提高了測定的長期穩(wěn)定性。
圖1d概述了佩戴者表皮上的可穿戴電子設(shè)備，顯示了其完全集成、皮膚構(gòu)象和緊湊性的特性。為了獲取記錄的電化學(xué)數(shù)據(jù)并傳輸?shù)揭苿咏K端，可穿戴電子設(shè)備使用了三種電路，包括模擬前端（AFE）、反向離子電泳和藍(lán)牙低能（BLE），如圖1e所示。AFE為MN貼片的生物傳感提供了一個電路。反向離子導(dǎo)入模塊由電池獨立供電，以避免信號串?dāng)_。BLE作為一個數(shù)據(jù)采集模塊，與AFE進(jìn)行交互。所有這些子組件都是由一個可充電的鋰離子電池供電的。
圖1：| 基于TDN-Ng的核酸實時監(jiān)測的集成可穿戴系統(tǒng)綜述。a患者表皮可穿戴設(shè)備的工作流程和視圖。所有數(shù)據(jù)分別傳輸?shù)诫娮釉O(shè)備RE、WE和CE，分別參考參考電極、工作電極和對電極。b插圖顯示了微針上的工程生物傳感界面，其中TDN作為錨點與石墨烯和NgAgo-gDNA結(jié)合，P指磷酸化。c生物傳感機(jī)制示意圖。增強(qiáng)的TDN-Ng界面選擇性地識別目標(biāo)核酸，產(chǎn)生不同的電勢，產(chǎn)生電化學(xué)信號輸出。d佩戴在患者手臂上的整個集成可穿戴系統(tǒng)的照片。比例尺，1厘米。e柔性電路板電子器件的方框圖。電化學(xué)模擬前端（AFE）進(jìn)行電化學(xué)傳感以獲取信號，藍(lán)牙低能（BLE）模塊處理信號，并通過藍(lán)牙天線將數(shù)據(jù)傳輸?shù)酵獠侩娮釉O(shè)備。反向離子導(dǎo)入模塊與電池單獨連接。電池被連接到電路板和USB充電端口。比例尺，1厘米。
TDN-Ng MNs的體外評價
完成可穿戴系統(tǒng)開發(fā)后，作者對可穿戴系統(tǒng)進(jìn)行了體外評價。作為一種集成的可穿戴電子系統(tǒng)，最終需要在真實場景中實現(xiàn)對目標(biāo)核酸的實時監(jiān)測。為了便于該系統(tǒng)的實際應(yīng)用，作者進(jìn)一步研究了其靈敏度、定量檢測、長期穩(wěn)定性、特異性和抗干擾性能。結(jié)果顯示，所制備的TDN-Ng MNs貼片在體外表現(xiàn)出16天的長期穩(wěn)定性，可實時定量、靈敏地監(jiān)測不同濃度的靶cfDNA和RNA。文章也指出，TDN-Ng MN貼片可耐受0.3 nM的非特異性核酸和80%的胎牛血清（FBS）干擾，也可在特異性識別目標(biāo)EBV cfDNA。
圖2：| TDN-Ng MNs對cfDNA和RNA的體外檢測性能。a. TDN Ng-MN貼片在受激ISF、37°C、pH 7.4和0.01M PBS中不同濃度cfDNA的實時電流反應(yīng)b.電流相應(yīng)與目標(biāo)濃度的校準(zhǔn)曲線。c. 從圖4b中收集的曲線斜率值d. TDN-Ng MN貼片在體外培養(yǎng)20天的長期穩(wěn)定性 e. TDN-Ng特異性 f. TDN-Ng MN貼片在不同濃度胎牛血清下對3×10−12 M靶cfDNA的抗干擾性能。g. 研究NgAgo-gDNA復(fù)合物與3 nM RNA-168和RNA-351的結(jié)合能力。h.通過TDN-Ng MN記錄的RNA-168和RNA-351的動態(tài)變化。
使用集成MNs的體內(nèi)監(jiān)測的性能和評價
完成體外評價后，作者進(jìn)行了體內(nèi)評價。在這項工作中，作者進(jìn)一步驗證了TDN-Ng MNs在體內(nèi)用于實時監(jiān)測核酸。結(jié)果顯示，該TDN-Ng MN系統(tǒng)不僅能有效區(qū)分陽性組和NTC組，而且還能可靠地監(jiān)測體內(nèi)靶標(biāo)cfDNA和RNA的動態(tài)變化。此外，該TDN-MN裝置也可在體內(nèi)表現(xiàn)出14天的可靠穩(wěn)定性。
圖3：| TDN-Ng MNs體內(nèi)驗證。a. 在小鼠模型實驗中，實時監(jiān)測的示意圖和時間線，在整個實驗過程中，對一只小鼠使用一個TDN-Ng MN貼片。每只小鼠均進(jìn)行(I)化學(xué)發(fā)光生物成像，（II）TDN-Ng MNs，（III）PCR檢測。TDN-Ng MN貼片首先在PBS（37°C，0.01M，pH 7.4）中校準(zhǔn)100秒，以消除使用前的傳感器背景變化。藍(lán)線表示工作模式。小鼠皮膚處理步驟如下：角質(zhì)層磨砂膏，75%乙醇消毒，TE緩沖液（pH 8.0）涂抹，棉花干燥。在整個過程中，小鼠被固定在一個熱板上。b. 小鼠在不同時間點的2h、24 h、48 h、168 h的平行演示。c.在2h、24 h、48 h、168 h時，實時動態(tài)曲線的斜率值。d. 通過TDN-Ng MNs和金標(biāo)準(zhǔn)PCR記錄的體內(nèi)靶cfDNA的動態(tài)變化。 e用TDN-Ng MNs和金標(biāo)準(zhǔn)PCR和RT-PCR檢測靶標(biāo)cfDNA和RNA的相應(yīng)圖譜。f. TDN-Ng MNs在體內(nèi)的長期穩(wěn)定性。g. 用TDN-Ng MN貼片在36 h內(nèi)連續(xù)實時監(jiān)測SA膿毒癥小鼠。h.用TDN-Ng MN貼片在36 h內(nèi)連續(xù)實時監(jiān)測PA膿毒癥小鼠。
總結(jié)
綜上所述，本研究提出了無線集成可穿戴電子設(shè)備，通過工程生物傳感接口實時監(jiān)測膿毒癥相關(guān)動物模型的縱向核酸。
基于TDN和Ng系統(tǒng)的協(xié)同作用，可穿戴系統(tǒng)能夠連續(xù)跟蹤體內(nèi)無細(xì)胞DNA和RNA靶點的動態(tài)變化，靈敏度為0.3 fM，在體內(nèi)17天內(nèi)具有可靠的穩(wěn)定性。
作者還討論了TDN-17隨空間高度增加對TDN-Ng系統(tǒng)的靈敏度增強(qiáng)和實時監(jiān)測動態(tài)平衡的機(jī)理。
目前這項工作的無擴(kuò)增策略代表了基于核酸的可穿戴設(shè)備的飛躍，并加速了用于ICU醫(yī)療保健管理的下一代生物傳感器的出現(xiàn)。
參考文獻(xiàn)：
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[2]Yang B, Wang H, Kong J, et al. Long-term monitoring of ultratrace nucleic acids using tetrahedral nanostructure-based NgAgo on wearable microneedles[J]. Nature Communications,
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