1. 背景介紹
在醫(yī)藥產(chǎn)品的制造過程中，生產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量必須始終如一?，F(xiàn)行的良好生產(chǎn)規(guī)范規(guī)定清潔是確保產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。原料藥和藥品的生產(chǎn)涉及一系列的加工步驟和各種設(shè)備的使用，在特定的藥品生產(chǎn)設(shè)備中進(jìn)行清潔，以防止藥品與其他活性成分（如非預(yù)期化合物或微生物污染）的交叉污染和摻假，可防止一些嚴(yán)重問題。清潔驗(yàn)證的好處在于可以識別和糾正可能危及藥品安全性和有效性的潛在問題，應(yīng)當(dāng)在藥品生命周期內(nèi)持續(xù)考察清潔方法的有效性，藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)當(dāng)定期進(jìn)行清潔驗(yàn)證，持續(xù)完善清潔后的可接受標(biāo)準(zhǔn)，并建立有效的清潔檢測措施。
2. 清潔驗(yàn)證的基本要素
清潔驗(yàn)證研究的基本要素主要包括殘留限值的制定，清潔程序（包括設(shè)備標(biāo)識，產(chǎn)品特性，如活性、毒性、溶解度、劑量、批量等，以及清潔劑的特性），分析方法及其驗(yàn)證以及取樣程序和必要的驗(yàn)證。
3. 殘留限值的制定
清潔驗(yàn)證應(yīng)證明，該程序能夠始終將先前生產(chǎn)的物質(zhì)的殘余物去除到可接受的水平，并且清潔程序本身不會(huì)對設(shè)備造成不可接受的殘留物水平。設(shè)定的限度應(yīng)該是實(shí)際的、可實(shí)現(xiàn)的和合理的。在活性藥物成分生產(chǎn)中，可能存在部分反應(yīng)物和不需要的副產(chǎn)品，這些副產(chǎn)品可能未經(jīng)化學(xué)鑒定，也就意味著這些物質(zhì)的毒性是未知的。因此，這些物質(zhì)也應(yīng)當(dāng)被予以關(guān)注，制藥企業(yè)應(yīng)基于合理的科學(xué)論證來決定哪些殘留物需要被量化。
4. 清潔程序
清潔程序應(yīng)足夠詳細(xì)，以消除清潔過程中任何不一致的可能性。在確定設(shè)備的最佳清潔程序時(shí)，必須結(jié)合要清除的產(chǎn)品殘留物、可用的清潔劑和清潔技術(shù)對設(shè)備設(shè)計(jì)進(jìn)行詳細(xì)評估，（1）待評估的設(shè)備參數(shù)（待清潔設(shè)備的標(biāo)識、難以清潔的區(qū)域、材料性質(zhì)、是否易于拆卸、是否固定）；（2）待清潔殘留物（清潔限度、殘留物的溶解度、接觸時(shí)間）；（3）待評估的清潔劑參數(shù)（最好是工藝中通常使用的物料、可用清潔劑（除非絕對需要，盡量減少清潔劑的使用）、溶解度特性、環(huán)境因素、健康和安全考慮）；（4）待評估清潔技術(shù)（手動(dòng)清洗、在線清洗（Cleaning in Place，CIP）、離線清洗（Cleaning out of Place，COP）、半自動(dòng)、自動(dòng)、時(shí)間因素清洗循環(huán)次數(shù)）。
5. 清潔驗(yàn)證的分析方法
用于檢測殘留物的分析方法應(yīng)針對待分析的物質(zhì)或物質(zhì)類別（例如，產(chǎn)品殘留物、賦形劑、分解產(chǎn)物、防腐劑、清潔劑殘留物和/或內(nèi)毒素），并在進(jìn)行清潔驗(yàn)證研究之前進(jìn)行驗(yàn)證。如果沒有檢測到污染或殘留，并不意味著清洗后沒有殘留污染物。這只意味著樣品中不存在高于分析方法靈敏度或檢出限的污染物。清潔驗(yàn)證分析方法的基本要求如下：（1）方法的靈敏度應(yīng)適用于計(jì)算得到的殘留限值；（2）方法應(yīng)實(shí)用、快速，并盡可能實(shí)用公司現(xiàn)有的儀器；（3）方法應(yīng)根據(jù)ICH，中國藥典，美國藥典和歐洲藥典要求進(jìn)行驗(yàn)證；（4）分析方法開發(fā)應(yīng)包括擦拭回收率的研究，以挑戰(zhàn)取樣和測試方法；（5）設(shè)備表面的材質(zhì)類型不同，樣品的吸附程度可能不一致，導(dǎo)致的擦拭回收情況存在差異；（6）樣品取樣和檢測的時(shí)間間隔，可能會(huì)影響樣品的穩(wěn)定性。
清潔殘留物的分析方法一般分為兩種專屬性分析方法和非專屬性分析方法。專屬性分析方法表示對特定的目標(biāo)進(jìn)行分析的方法，而非專屬性分析方法則不能針對某一種化合物進(jìn)行分析，表1中給出了常見的專屬性和非專屬性分析方法。目前各檢查機(jī)構(gòu)更加傾向于使用專屬性分析方法，但并不意味非專屬性分析方法不能夠使用，在有充分的理由的情況下，非專屬性分析方法也是可以被接受使用的。
表1 常見的專屬性和非專屬性分析方法
目標(biāo)殘留物的測定有多種分析方法可以選擇。選擇用于測量殘留物的分析方法與目標(biāo)殘留物的化學(xué)性質(zhì)以及為殘留物的允許殘留限值密切相關(guān)?；瘜W(xué)性質(zhì)包括目標(biāo)殘留物是有機(jī)物還是無機(jī)物，溶于水或其他溶劑，其極性程度，以及在清潔環(huán)境中的穩(wěn)定性。選擇合適的分析方法的一個(gè)關(guān)鍵因素是方法產(chǎn)生的結(jié)果與目標(biāo)殘留物有邏輯、科學(xué)的聯(lián)系。如果樣品中的目標(biāo)物是有機(jī)化合物，非電離的，那么使用電導(dǎo)率作為分析工具顯然是不合適的，因?yàn)樵诜治鰳悠分心繕?biāo)殘留物的存在與測試樣品中電導(dǎo)率的測量之間沒有科學(xué)的關(guān)系。
通常情況下，一般優(yōu)選專屬性分析方法中的高效液相色譜法，高效液相色譜法能夠準(zhǔn)確的告訴我們殘留藥物的具體量，在藥物活性較高時(shí)，這一點(diǎn)更加重要。高效液相色譜可以配備不同類型的檢測器，以適應(yīng)不同類型的物質(zhì)檢測，例如，紫外檢測器，二極管陣列檢測器，質(zhì)譜檢測器，蒸發(fā)光散射檢測器以及折光檢測器等等。目前大部分藥物的含量分析方法都會(huì)選用高效液相色譜法，在含量分析方法開發(fā)時(shí)，盡量使靈敏度更高，這樣可以直接應(yīng)用于清潔驗(yàn)證的樣品分析，避免再次開發(fā)新的分析方法。此外，HPLC方法還可以對穩(wěn)定性較差的藥物的降解產(chǎn)物進(jìn)行分析，分析方法開發(fā)時(shí)可以同時(shí)開發(fā)藥物活性成分和降解產(chǎn)物同時(shí)分析的方法。
非專屬性分析方法通常是測量由各種化學(xué)物質(zhì)的貢獻(xiàn)所產(chǎn)生的總特性的方法。非專屬性分析方法最常用的方法即總有機(jī)碳分析方法。總有機(jī)碳都提供了一個(gè)整體性質(zhì)的測量，但沒有提供關(guān)于有機(jī)碳來源的化學(xué)性質(zhì)的信息。當(dāng)該被用于一個(gè)目標(biāo)殘留物時(shí)，我們并不能知道殘留量所對應(yīng)的具體物質(zhì)，但所獲得的總量卻可以告訴我們目標(biāo)的殘留物是否符合了允許的最低限值?？傆袡C(jī)碳較高效液相色譜法相比有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）參數(shù)更加簡單，方法開發(fā)時(shí)間短；（2）分析時(shí)間快，縮短檢測時(shí)長，檢測效率高；（3）可以同時(shí)監(jiān)測藥物活性成分、賦形劑、降解產(chǎn)物和消毒劑等物質(zhì)；（4）此外，TOC在中藥制劑、疫苗以及體外診斷制劑的清潔驗(yàn)證的應(yīng)用中具有非常明顯的優(yōu)勢。
6. 清潔驗(yàn)證分析方法的驗(yàn)證
無論是專屬性分析方法還是非專屬性分析方法，在方法選定后，都應(yīng)當(dāng)按照現(xiàn)行的法規(guī)要求，對分析方法進(jìn)行驗(yàn)證，確定分析方法可以滿足預(yù)期的用途。清潔分析方法驗(yàn)證的參數(shù)通常包括：專屬性、檢測限與定量限、線性與范圍、精密度（儀器精密度、重復(fù)性和中間精密度）、取樣回收率以及溶液穩(wěn)定性等。
專屬性：清潔驗(yàn)證專屬性分析方法相較于一般分析方法，存在更多的干擾因素，例如設(shè)備表面的潔凈程度，棉簽的干擾因素以及擦拭溶劑。在清潔分析中，除了活性成分，我們還要關(guān)注活性成分與各相關(guān)雜質(zhì)以及存在響應(yīng)的輔料峰的分離。在清潔分析方法研究中，如果存在干擾物質(zhì)，則應(yīng)盡可能將其與主峰分離，以避免方法不能準(zhǔn)確定量。非專屬性分析方法由于其不具備專屬性，例如總有機(jī)碳，在此種情況下，應(yīng)當(dāng)保證空白檢測結(jié)果的可重復(fù)性，使用空白檢測結(jié)果對在殘留物樣品的檢測結(jié)果進(jìn)行校正。
檢測限和定量限：專屬性分析方法如果選用的是藥物活性成分的含量分析方法，一般對照品濃度較高，并且法規(guī)和指南中不要求在含量方法的驗(yàn)證過程中進(jìn)行檢測限和定量限的研究，但清潔驗(yàn)證的目的是為了避免交叉污染的產(chǎn)生，所以濃度一般較含量分析方法相比要低很多，必須要進(jìn)行檢測限和定量限的研究，，以保證分析方法具有足夠的靈敏度，可以有效的定量殘留物質(zhì)，一般采用信噪比方法進(jìn)行研究，檢測限取信噪比為3:1，定量限取信噪比為10:1。非專屬性分析方法可以采用多次測定空白，獲得空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，再計(jì)算檢測限和定量限。
線性是指在一定測定范圍內(nèi)，被測物質(zhì)濃度與檢測值成正比關(guān)系的程度。線性是定量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。線性的設(shè)計(jì)應(yīng)滿足預(yù)期使用范圍?？梢耘渲茷閮?chǔ)備溶液進(jìn)行稀釋，也可以分別精密度稱量制備，但應(yīng)至少制備5個(gè)濃度的溶液，并測定。以檢測值和被測物質(zhì)濃度的函數(shù)作圖，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，判斷在該范圍內(nèi)是否具有良好的線性關(guān)系。清潔驗(yàn)證中，線性的最低限應(yīng)從LOQ開始，有時(shí)可能同一種物質(zhì)存在不同劑型，其限度可能不一致，可以將線性的最高限應(yīng)考慮覆蓋更高的水平，使該方法可以同時(shí)應(yīng)用于不同的劑型。
范圍是指該分析方法使用的最低到最高濃度區(qū)間，應(yīng)根據(jù)具體應(yīng)用，最線性，精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，確定方法的使用范圍。
取樣回收率：清潔分析方法的回收率的測試方式不同于一般的分析方法的回收率測試，清潔分析方法的回收率研究需要考慮擦試劑是否能有效的回收藥物活性成分，以及棉簽個(gè)數(shù)是否有響應(yīng)。擦試劑一般選擇水，乙醇，異丙醇以及乙醇或者異丙醇和水的不同比例的混合溶液，如采用其他溶劑，因其可能對生產(chǎn)設(shè)備造成污染，可能需要對此進(jìn)行評估。提取溶劑如選擇HPLC和UPLC方法，盡量和流動(dòng)相相近，以減小溶劑效應(yīng)對峰型的影響，如選取TOC法，則應(yīng)使用水，TOC法的擦拭溶劑也只能選取水。由于在生產(chǎn)過程中物料會(huì)與不同的材質(zhì)的生產(chǎn)設(shè)備相互接觸，不同的材質(zhì)對被測物的吸附能力可能存在差異，采用相同的擦拭回收方法，可能會(huì)出現(xiàn)取樣回收結(jié)果不一致的情況，因此還應(yīng)對被測物直接接觸的不同材質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確度研究。由于清潔分析方法的特殊性，所以準(zhǔn)確度要求同其他定量方法要更低，但應(yīng)不低于50%，并應(yīng)該采用校正因子的計(jì)算方式，將測定結(jié)果修正為實(shí)際結(jié)果。在回收率研究過程中，因?yàn)椴猎噭w積會(huì)參與最終的計(jì)算，但蘸有擦試劑的棉簽在擦拭設(shè)備表面時(shí)，擦試劑非常容易殘留在設(shè)備表面，所以有的研究人員通過使用第二根或者第三根干的棉簽進(jìn)行回收，以保證藥物活性物質(zhì)可以被回收，研究過程見圖1。
圖 1 準(zhǔn)確度研究
精密度：精密度考察分為三部分：儀器精密度，重復(fù)性和中間精密度。儀器精密度又分為日內(nèi)精密度和日間精密度，采用對照品溶液，同一時(shí)間連續(xù)進(jìn)樣考察日內(nèi)精密度，分別在不同天連續(xù)進(jìn)樣考察日間精密度。由于清潔驗(yàn)證分析方法的考察，就是人員是非常重要的因素，因?yàn)椴潦眠^程中人員的擦拭力度以及方式可能都會(huì)存在一些差異，所以需要進(jìn)行中間精密度研究，由第二個(gè)實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行重現(xiàn)，確保實(shí)驗(yàn)可以在不同人員操作的情況得以重現(xiàn)，并且清潔驗(yàn)證中殘留物的取樣人員應(yīng)進(jìn)行取樣的培訓(xùn)。在清潔驗(yàn)證中，擦拭取樣過程，對取樣工具、擦拭溶劑、取樣人員的操作等都有一定的要求，總的來說比較復(fù)雜。為保證方法舉有良好的重現(xiàn)性。精密度試驗(yàn)必不可少，不僅要考察重復(fù)性，還要對不同人員的操作進(jìn)行評估，因此中間精密度或重現(xiàn)性也是非常必要。同時(shí)還要對重復(fù)性和中間精度度或重現(xiàn)性的數(shù)據(jù)進(jìn)行整體評估，確保在不同人以及不同情況下仍能保證取樣過程的正確性。
溶液穩(wěn)定性：對于清潔驗(yàn)證分析方法的研究，溶液穩(wěn)定性的研究必不可少。一方面是取樣的地方可能沒有樣品分析的儀器，需要到很遠(yuǎn)的地方法進(jìn)行測定，另外一方面，清潔驗(yàn)證的過程并不一定是短時(shí)間內(nèi)可以完成的，可能分為幾個(gè)步驟分別進(jìn)行，為了減少檢測的成本，盡可能將樣品在同一次實(shí)驗(yàn)中完成。對于不穩(wěn)定的樣品，我們需要對樣品制備的方式或者樣品的存儲(chǔ)條件進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，例如更換樣品溶液的稀釋劑或者將樣品存儲(chǔ)于5℃進(jìn)行存放。
7. 取樣程序和必要的驗(yàn)證
根據(jù)清潔經(jīng)驗(yàn)和設(shè)備設(shè)計(jì)確定難以清潔的設(shè)備位置（最壞情況）。樣品表面積通常在25-100cm2之間變化，并且應(yīng)足夠大，以允許回收足以通過分析方法檢測的殘留量。研究所需的樣品數(shù)量取決于各種因素，如設(shè)備表面積、材質(zhì)、設(shè)計(jì)、形狀和工作原理?？紤]到設(shè)備產(chǎn)品接觸面上殘留物的均勻性，必須采集多個(gè)樣品，包括最難清潔的位置。
取樣是清潔方法驗(yàn)證的關(guān)鍵步驟。清潔方法驗(yàn)證采用了不同的取樣方法。選擇的取樣方法都必須符合合理的科學(xué)判斷，并且必須支持研究的目標(biāo)，即證明設(shè)備中殘留物數(shù)量已減少到可接受的水平。經(jīng)典的取樣方式分別為：直接表面取樣（棉簽擦拭法）和間接取樣（沖淋取樣法）。這兩種方法的結(jié)合通常是最理想的，特別是在設(shè)備部件人難以接近進(jìn)行直接表面取樣的情況下，兩種方法的比較見表表2。
表2棉簽擦拭法和沖淋取樣法比較表
上述內(nèi)容對清潔驗(yàn)證的基本要素進(jìn)行詳細(xì)的闡述，這些內(nèi)容還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，還應(yīng)當(dāng)基于風(fēng)險(xiǎn)角度結(jié)合人機(jī)料法環(huán)五要素，見圖2，針對具體產(chǎn)品和實(shí)際情況，設(shè)計(jì)最合理的清潔程序，保證清潔驗(yàn)證的成功。
圖2 清潔驗(yàn)證魚骨圖
8. 小結(jié)
清潔驗(yàn)證是防止藥品污染和交叉污染的重要手段，以避免藥物成分之間潛在的臨床顯著協(xié)同作用，而穩(wěn)健有效的清潔程序的實(shí)現(xiàn)是避免污染的主要方式，因此，應(yīng)采取有效的清潔措施同時(shí)提供書面證據(jù)，證明所采用的清潔方法能夠始終將產(chǎn)品（包括中間體和雜質(zhì)、清潔劑和外來物質(zhì)等）帶入后續(xù)產(chǎn)品的潛在殘留控制在預(yù)定水平以下，保證藥品的安全性和純度，進(jìn)而保證了患者的用藥安全。
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