摘要
藥品中微量水平的遺傳毒性物質(zhì)具有引發(fā)腫瘤甚至癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，并且該致癌風(fēng)險(xiǎn)可能與劑量沒有相關(guān)性。因此，目前各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求對(duì)藥品中遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格控制。本綜述通過查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)、指導(dǎo)原則，從監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)藥品中遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管策略、遺傳毒性雜質(zhì)來源、檢測方法及清除策略4個(gè)方面進(jìn)行了系統(tǒng)的總結(jié)綜述。該綜述為藥品中遺傳毒性雜質(zhì)的控制/清除、檢測提供了參考和依據(jù)。
關(guān)鍵詞
遺傳毒性雜質(zhì)；來源；檢測方法；清除
通常，藥品中的活性成分可以通過全合成或者以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物，進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以獲得。而上述這兩種情況，均需要使用多種化學(xué)試劑并經(jīng)過一步或多步化學(xué)反應(yīng)。因此，即使經(jīng)過純化步驟，在最終的原料或制劑中，還會(huì)存在一定量的和藥效無關(guān)的雜質(zhì)。同時(shí)，在藥品的制劑或儲(chǔ)存過程中，也可能生成一定量的雜質(zhì)。
這些雜質(zhì)和藥效無關(guān)，同時(shí)可能具有毒性，甚至具有遺傳毒性和致癌性。美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration, FDA)、歐洲藥品管理局(European Medicines Agency，EMA)等各國藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)自2006年已開始持續(xù)關(guān)注原料藥中遺傳毒性雜質(zhì)的情況，及可能對(duì)人體健康造成的負(fù)面影響。
遺傳毒性雜質(zhì)是指能夠直接或間接損傷細(xì)胞DNA，造成DNA突變并伴有致癌性危害人類健康的物質(zhì)。其對(duì)DNA的損害包括染色體斷裂、DNA重組及復(fù)制過程中共價(jià)鍵的插入和修飾，也包括在細(xì)胞水平上產(chǎn)生遺傳毒性物質(zhì)而造成的突變。由于微量水平的遺傳毒性物質(zhì)也會(huì)對(duì)服藥者造成不可逆轉(zhuǎn)的危害，可能會(huì)引發(fā)腫瘤甚至癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，并且該致癌風(fēng)險(xiǎn)可能與劑量沒有相關(guān)性，存在遺傳毒性化合物在極低劑量水平下導(dǎo)致人體DNA損傷，且該損傷效應(yīng)可通過遺傳物質(zhì)的復(fù)制而不斷放大的風(fēng)險(xiǎn)。因此對(duì)遺傳毒性雜質(zhì)的檢測和控制極其重要。
遺傳毒性雜質(zhì)的種類較多，有黃曲霉素類、亞硝胺化合物、烷基-氧化偶氮基化合物，磺酸酯類、氯代烷烴類、苯胺類、硝基苯、多環(huán)芳烴以及疊氮化物等。由于黃曲霉素類、亞硝基化合物、烷基-氧化偶氮基化合物毒性較強(qiáng)，屬于特殊關(guān)注隊(duì)列(表1)。
近年來，亞硝胺化合物殘留而引發(fā)藥品召回的事件頻發(fā)。2018年，浙江省華海藥業(yè)在纈沙坦原料藥中檢測出微量的亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)N-亞硝基二甲胺(N-nitrosodimethylamine，NDMA)后，亞硝胺類雜質(zhì)事件引起了業(yè)內(nèi)的普遍關(guān)注。2019年3月，F(xiàn)DA公布氯沙坦鉀片中亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸(N-Nitroso-Nmethyl-4-aminobutyric acid，NMBA)超出暫定控制限度(0.96ppm)。同年9月，F(xiàn)DA發(fā)布安全警告，雷尼替丁中檢出亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)NDMA，之后也導(dǎo)致相關(guān)產(chǎn)品被召回。隨后FDA又在降糖藥二甲雙胍中檢出微量NDMA。2020年7月，WHO公布在賽諾菲公司的利福平、利福噴丁中檢出亞硝胺雜質(zhì)MNP、1-環(huán)戊基-4-亞硝基哌嗪(1-cyclopentyl-4-nitrosopiperazine，CPNP)，隨后FDA也公布了其暫定限度為5和20ppm。2021年，因含有亞硝胺化合物N亞硝基-伐尼克蘭，輝瑞公司召回戒煙藥Chantix。次年又因亞硝胺類雜質(zhì)超標(biāo)，長效降壓藥鹽酸普萘洛爾被召回。上述事件總結(jié)見圖1。此類亞硝胺雜質(zhì)事件頻發(fā)，增加了患者使用藥物的風(fēng)險(xiǎn)，也給企業(yè)帶來了無法估計(jì)的損失，同時(shí)也給制藥行業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)敲響了警鐘。
本綜述希望通過對(duì)藥品中亞硝胺類雜質(zhì)的來源、檢測方法、控制策略和清除的方法進(jìn)行探討，為相關(guān)人員提供參考。
1、亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管
20世紀(jì)以前，對(duì)于藥品中遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管的制度和措施幾乎空白。隨著檢測技術(shù)和監(jiān)管理念的發(fā)展，近年來，各個(gè)國家和地區(qū)的藥物監(jiān)管措施的逐漸完善。
2002年，EMA的專利藥物委員會(huì)(Committee for Proprietary Medicinal Products，CPMP)后更名為人用藥物委員會(huì)(Committee for Human Medicinal Products，CHMP)發(fā)布關(guān)于遺傳毒性雜質(zhì)的意見書。該意見書按照雜質(zhì)是否存在有證據(jù)的閾值而將遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行分類：①有足夠的研究證據(jù)支持其閾值的雜質(zhì)，建議參照ICH Q3C中二類溶劑的方法進(jìn)行控制；②無充分閾值研究證據(jù)的雜質(zhì)，采用“最低技術(shù)可行”(as low as technically feasible，ALATF)的原則進(jìn)行控制。
2004年，EMA發(fā)布遺傳毒性雜質(zhì)限度指南(草案)，對(duì)意見書進(jìn)行了修改。默認(rèn)完全消除遺傳毒性雜質(zhì)的引入風(fēng)險(xiǎn)是無法實(shí)現(xiàn)的，改以“最低合理可行”原則(as low as reasonably practical，ALARP)替代了“最低技術(shù)可行”(ALATF)原則，建議用毒理學(xué)關(guān)注閾值(threshold of toxicological concern，TTC)作為遺傳毒性雜質(zhì)的可接受限度。TTC根據(jù)半數(shù)致癌劑量(median toxic dose，TD50)的五萬分之一為攝入量進(jìn)行線性外推，從而得到十萬分之一(10-5)致癌率的攝入量，并以此數(shù)值作為每人每天最高攝入量。上述TD50的數(shù)據(jù)通常來源于致癌性強(qiáng)度數(shù)據(jù)庫(carcinogenicity potency database，CPDB)以及嚙齒類動(dòng)物致癌性試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫。
由于部分遺傳毒性雜質(zhì)致癌性強(qiáng)，危害較大，即使低于“毒理學(xué)關(guān)注閾值”也會(huì)對(duì)人體有較大致癌風(fēng)險(xiǎn)，所以美國藥品研究與制造企業(yè)協(xié)會(huì)(Pharmaceutical Research and Manufacturers of America，PhRMA)又提出了“五分類”系統(tǒng)，將遺傳毒性雜質(zhì)分為5類。2014年，人用藥品注冊(cè)技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)(the international council for harmonisation of technical requirements for pharmaceuticals for human use，ICH)在EMA、PhRMA和FDA的基礎(chǔ)上頒布了關(guān)于遺傳毒性雜質(zhì)指南ICH M7，對(duì)“五分類”做了一些增補(bǔ)，見表2。
2017年，ICH評(píng)估和控制藥物中DNA反應(yīng)性(致突變)雜質(zhì)的ICH M7指導(dǎo)原則將致癌風(fēng)險(xiǎn)高的N-亞硝基類化合物列為“特殊關(guān)注隊(duì)列”，并根據(jù)其致癌性相關(guān)分析，將其列為“具有已知致癌致突變性”的Ⅰ類雜質(zhì)。
根據(jù)ICH M7和EMA相關(guān)指南，作為“特殊隊(duì)列”中的亞硝胺類雜質(zhì)應(yīng)根據(jù)藥物每日最高使用劑量計(jì)算終身使用的藥物中亞硝胺類雜質(zhì)的臨時(shí)限度。也可根據(jù)TD50等其毒理學(xué)參數(shù)計(jì)算每日允許暴露量(permitted daily exposure，PDE)或每日允許攝入量(acceptable daily intake，ADI)。然后在此基礎(chǔ)上，根據(jù)每日用藥量和用藥周期對(duì)其限度進(jìn)行確定。若在CPDB及嚙齒類動(dòng)物致癌性試驗(yàn)數(shù)據(jù)庫中未查見亞硝胺雜質(zhì)的TD50值，可以采用相似結(jié)構(gòu)化合物的TD50值計(jì)算雜質(zhì)限度。
當(dāng)然，存在著一種藥物中含有多種遺傳毒性雜質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)。EMA安全工作小組(safety working party，SWP)對(duì)于含有兩種及以上的亞硝胺類雜質(zhì)的限度控制，提出了兩種監(jiān)管策略：第一種策略是按照致癌風(fēng)險(xiǎn)最強(qiáng)的一種亞硝胺雜質(zhì)的限度進(jìn)行控制；另一種策略將總含量控制在罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)不超過10-5的水平。同時(shí)，SWP提供一種替代方法，建議為每種亞硝胺雜質(zhì)設(shè)定一個(gè)特定的限值，從而確保所有檢出的亞硝胺雜質(zhì)的總和不超過10-5的總風(fēng)險(xiǎn)水平。而對(duì)于毒理學(xué)數(shù)據(jù)不足的亞硝胺類雜質(zhì)的控制限度，比如N-亞硝基甲乙胺(N-nitroso-methylethylamine，NMEA)、N-亞硝基二丙胺(N-nitrosodi-N-propylamine，NDPA)胺類化合物，EMA推薦使用結(jié)構(gòu)上與其最為接近的亞硝胺類化合物的TD50為基礎(chǔ)估算其限度。而對(duì)于短期服用藥物，ICH M7提出了可使用小于壽命(less than lifetime，LTL)的方法計(jì)算其限度。但是，當(dāng)前多數(shù)CHMP專家基于亞硝胺類雜質(zhì)暴露量與DNA損傷無嚴(yán)格線性關(guān)系，同時(shí)經(jīng)過LTL計(jì)算后，限度偏高，造成短期風(fēng)險(xiǎn)增大。
我國對(duì)于遺傳毒性雜質(zhì)的研究起步較晚，2017年我國加入ICH后，相繼頒布了指導(dǎo)原則。2019年1月，國家藥典委員會(huì)發(fā)布關(guān)于遺傳毒性雜質(zhì)指導(dǎo)原則審核稿，指導(dǎo)遺傳毒性雜質(zhì)的分類和控制，《中國藥典》2020版四部通則中新增了該指導(dǎo)原則。2020年5月，我國國家藥品監(jiān)督管理局藥品藥審中心網(wǎng)站發(fā)布了《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》，該原則對(duì)準(zhǔn)備注冊(cè)申請(qǐng)上市和已上市化學(xué)藥品中亞硝胺類雜質(zhì)的研究和控制提供了指導(dǎo)原則。
2、亞硝胺類傳毒性雜質(zhì)的來源
藥品中亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的產(chǎn)生的原因復(fù)雜且多樣。從產(chǎn)生機(jī)理角度分析，亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)理分為兩大類：一是經(jīng)典的亞硝化反應(yīng)。如不同胺類化合物與不同亞硝化試劑相互作用發(fā)生的亞硝化反應(yīng)，主要以仲胺和叔胺化合物為主，亞硝化試劑主要包括亞硝酸根離子、亞硝酰鹵化物、亞硝酸酯、三氧化二氮和四氧化二氮等。二是非經(jīng)典類的亞硝化反應(yīng)。硝基胺高溫下的還原反應(yīng)，硝基胍用鋅粉還原可形成亞硝胺；肼類化合物如偏二甲肼發(fā)生的氧化反應(yīng)；還有腙臭氧分解成亞硝胺；有機(jī)金屬的亞硝化；將格氏試劑加入到一氧化氮中可以得到亞硝基羥胺等。其中常見的反應(yīng)就是亞硝化反應(yīng)，任何含N-H的化合物都可能發(fā)生亞硝化反應(yīng)，比如胺、(雜)酰胺、氨基甲酸酯、羥胺、羥胺醚、肼、腙、酰肼、脲和胍。上述反應(yīng)機(jī)理如圖2所示。
藥物在生產(chǎn)、儲(chǔ)藏的過程中均有可能產(chǎn)生亞硝胺類雜質(zhì)。華海藥業(yè)在纈沙坦的合成路線中使用了疊氮化鈉，其溶劑為N, N-二甲基甲酰胺(N, Ndimethylformamide，DMF)。該合成路線相對(duì)于之前的合成路線，具有收率高的特點(diǎn)。但經(jīng)研究表明，溶劑DMF在合成過程中，會(huì)降解生成二甲胺。二甲胺會(huì)與淬滅過量的疊氮化鈉使用的亞硝酸鈉發(fā)生亞硝化反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生亞硝胺類雜質(zhì)NDMA。強(qiáng)效組胺H2受體拮抗劑雷尼替丁本身結(jié)構(gòu)中的硝基和二甲胺發(fā)生也會(huì)亞硝化反應(yīng)，降解產(chǎn)生NDMA。與雷尼替丁結(jié)構(gòu)相似，二甲雙胍結(jié)構(gòu)中也含有一個(gè)二甲胺，容易與亞硝酸鹽生成亞硝胺雜質(zhì)。
基于以上機(jī)理，亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)來源主要有3種途徑：一是來源于生產(chǎn)工藝。在生產(chǎn)過程中引入了胺類化合物或亞硝化試劑，如起始原料、反應(yīng)物、中間體以及藥物合成中發(fā)生的副反應(yīng)。此外還應(yīng)考慮某些溶劑、催化劑等也會(huì)降解生成仲胺或叔胺化合物。沙坦類中NDMA的來源就是生產(chǎn)工藝使用了胺類和亞硝酸鈉反應(yīng)產(chǎn)生的。并且生產(chǎn)過程使用的溶劑DMF和N-甲基吡咯烷酮的水解或者熱降解分別產(chǎn)生仲胺如二甲胺和甲基丁胺，隨后發(fā)生N-亞硝化反應(yīng)，最終產(chǎn)生NDMA和NMBA；二是可能來源于儲(chǔ)存過程、包裝材料以及并線生產(chǎn)等。含有硝化纖維的泡罩包裝也會(huì)生成亞硝胺雜質(zhì)；三是來源于起始物、中間體或原料的降解產(chǎn)物。比如雷尼替丁中的NDMA雜質(zhì)是在儲(chǔ)存過程中降解產(chǎn)生的，尤其高溫加熱時(shí)生成的亞硝胺雜質(zhì)更多。
遺傳毒性雜質(zhì)具有重大的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)，是需要重點(diǎn)控制的雜質(zhì)，對(duì)遺傳毒性雜質(zhì)控制的水平可以反映藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的水平。因此為了人類的健康和安全，有必要了解其產(chǎn)生機(jī)理并建立一種靈敏的方法來檢測和定量藥品和藥品中的遺傳毒性雜質(zhì)。同時(shí)對(duì)雜質(zhì)的清除措施也需十分明確。
3、亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的清除
2020年6月，EMA就上市許可持有人如何避免在人用藥中產(chǎn)生亞硝胺類雜質(zhì)提出指導(dǎo)意見：調(diào)整生產(chǎn)工藝，提前預(yù)防亞硝胺化合物的生成；做好合成路線、起始原料、中間體、原料(溶劑、試劑、催化劑等)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，找出生成亞硝胺化合物的潛在原因；如若通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)確有亞硝胺化合物存在，應(yīng)考慮改變生產(chǎn)工藝、原料和中間體、原材料或初級(jí)包裝(如含有硝化纖維的泡罩包裝等)，以避免使用亞硝化劑；如果證明亞硝化劑與溶劑、試劑和催化劑的結(jié)合在整個(gè)過程中不可避免，則應(yīng)在原料藥和制劑生產(chǎn)中實(shí)施適當(dāng)?shù)目刂拼胧?/span>
FDA在21世紀(jì)提出“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”(quailty by design，QbD)理念，其被定義為基于一種科學(xué)和質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理之上，預(yù)先定義好目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量并強(qiáng)調(diào)對(duì)產(chǎn)品與工藝的理解及控制的一個(gè)系統(tǒng)的研發(fā)方法。對(duì)潛在遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的策略就是利用質(zhì)量源于設(shè)計(jì)提供更詳盡的對(duì)工藝的理解，最終確定雜質(zhì)產(chǎn)生的臨界區(qū)域。Madasu等采用上述策略，設(shè)計(jì)了氯沙坦鉀鹽的5步合成法。從設(shè)計(jì)源頭避免并控制雜質(zhì)的產(chǎn)生，才是控制雜質(zhì)產(chǎn)生的根本途徑。藥品在設(shè)計(jì)生產(chǎn)時(shí)，如避免不了雜質(zhì)的產(chǎn)生，也應(yīng)盡量控制雜質(zhì)在最終反應(yīng)4步以外產(chǎn)生，再設(shè)立雜質(zhì)清除步驟。
4、亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)分析方法研究進(jìn)展
由于亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)在極低的濃度就具有較強(qiáng)的毒性，同時(shí)該類雜質(zhì)具有低分子量、高親水性的特點(diǎn)，是檢測的難點(diǎn)。目前關(guān)于藥物中亞硝胺類雜質(zhì)的檢測方法，主要包括如高效液相色譜-紫外檢測器(HPLC-UV)、高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)等。
4.1 高效液相色譜法
高效液相色譜法是藥物分析中最為普遍的方法，其具有靈敏度高，專屬性好的優(yōu)點(diǎn)。70%以上的化合物都可以用高效液相色譜分離。由于亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的高親水性，十八烷基硅烷(octadecylsilyl，ODS)或苯基硅烷鍵合相色譜柱常用于亞硝胺類雜質(zhì)的分離。常使用的檢測器包括紫外檢測器、質(zhì)譜檢測器和熒光檢測器等。
4.1.1 紫外檢測器
由于其簡便性和可及性，帶紫外的液相色譜可應(yīng)用于較高濃度的遺傳毒性雜質(zhì)測定的快速篩查和定量。Sayaka-M等采用Inertsil ODS-3柱(150mm×4.6mm，5μm，GL Science)建立了高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器(photo-diode array detector，PDAD)檢測纈沙坦中NDMA的定量方法。該方法檢測限為0.057~0.17ppm，定量限為0.19~0.57ppm。上述方法可用于纈沙坦原料藥和市售產(chǎn)品中NDMA雜質(zhì)的快速篩查和定量。Kunjan等采用C18(250mm×4.6mm, 5μm)色譜柱建立了HPLC-UV同時(shí)測定纈沙坦中6種亞硝胺雜質(zhì)的定量方法，其檢測限為6~13ppm，定量限為20~41ppm。范婷婷等采用SHISEIDO C18型色譜柱(4.6mm×250mm，5µm)建立了HPLC-PDAD測定纈沙坦中N-二甲基亞硝胺含量。檢測限為0.01ppm，定量限為0.03ppm。
4.1.2 熒光檢測器與化學(xué)發(fā)光檢測器
當(dāng)然，紫外檢測器用于亞硝胺類雜質(zhì)的檢測存在著很多挑戰(zhàn)。首先需要對(duì)液相色譜條件優(yōu)化，比如流動(dòng)相組成、pH等需要花費(fèi)較長時(shí)間。此外，HPLC-UV方法的檢測限和定量限也較高。為了降低檢測限和定量限以達(dá)到遺傳毒性雜質(zhì)測定的需要，可以通過熒光衍生化法(fluorescence derivatizatio，F(xiàn)LD)或化學(xué)發(fā)光檢測法(HPLC-PR-CL)進(jìn)行檢測。
由于亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)結(jié)構(gòu)中無熒光基團(tuán)，因此需采用熒光衍生化法進(jìn)行熒光標(biāo)記，以提高檢測靈敏度。Zhao等采用柱前熒光標(biāo)記建立了高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)測定食品中N-亞硝基吡咯烷(N-nitrosopyrrolidine，NPYR)、N-亞硝基二乙胺(N-nitrosodiethylamine，NDEA)、N-亞硝基二丁胺(N-nitrosodibutylamine，NDBA)和N-亞硝基二丙胺(N-nitroso-di-N-propylamine，NDPA) 4種亞硝胺雜質(zhì)方法。該方法檢測限在1.3~2.5ng/L范圍內(nèi)。Takahiro等采用Capcell Pak C18MGII(5μm，4.6mm，250mm或100mm)色譜柱建立了高效液相色譜-光化學(xué)反應(yīng)-化學(xué)發(fā)光法(HPLC-PR-CL)分析再生水中NDMA的含量。檢測限為2ng/mL。該方法與固相萃取-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法相比具有相同的準(zhǔn)確度。但其具有比該法樣品用量小、分析時(shí)間快、操作方法簡單等優(yōu)點(diǎn)。
上述方法論述了對(duì)藥品、食品和水中亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的檢測方法和檢測限，檢測限可達(dá)到1~13ng/mL不等?？筛鶕?jù)遺傳毒性雜質(zhì)的性質(zhì)和含量選擇合適的檢測方式。但考慮到遺傳毒性雜質(zhì)的含量通常較低，常規(guī)液相色譜法只適用于含量較高的遺傳毒性雜質(zhì)的定量，因此HPLC的檢測限也往往達(dá)不到要求，需要靈敏度更高的檢測器來解決。
4.1.3 質(zhì)譜檢測器
由于較高的靈敏度，LC-MS法已被廣泛探索用于分析含量較低的遺傳毒性雜質(zhì)當(dāng)中。表3總結(jié)了FDA先后建立了液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法(liquid chromatography tandem high resolution mass spectrometry，LC-HRMS)對(duì)血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑類藥物、雷尼替丁、利福平、利福噴丁中遺傳毒性藥物檢測方法。
采用電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)的質(zhì)譜多為高分辨質(zhì)譜和串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜。FDA公布的幾種亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的檢測方法為高分辨質(zhì)譜。因其分辨率高、質(zhì)量精密度高等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用在藥品檢測中。Wohlfart等通過FDA的方法對(duì)15批利福平膠囊中的遺傳毒性雜質(zhì)MNP檢測。該方法采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，檢測結(jié)果為0.7~5.1ppm。其中一份樣品的測定結(jié)果略微大于FDA規(guī)定的上限(5ppm)。同時(shí)，該研究指出，F(xiàn)DA采用的外標(biāo)單點(diǎn)法可能由于個(gè)別樣品中MNP濃度超過了標(biāo)準(zhǔn)曲線法的線性范圍，而導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。劉博等建立LC-ESI-HRMS法測定54批鹽酸二甲雙胍緩釋片中7種亞硝胺雜質(zhì)的檢測方法。此外，LCMRM-MS也廣泛應(yīng)用于藥物中遺傳毒性雜質(zhì)的檢測中。Tao等建立了HPLC-ESI-MS/MS方法檢測30批利福平制劑中遺傳毒性雜質(zhì)MNP的含量。該方法與六通閥切換相結(jié)合，避免了利福平進(jìn)入質(zhì)譜儀造成污染。
采用LC-MS技術(shù)對(duì)遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行檢測時(shí)，藥品中的輔料、雜質(zhì)可能會(huì)對(duì)待測成分產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，對(duì)檢測結(jié)果造成影響。有文獻(xiàn)表明，與ESI離子源相比，使用大氣壓化學(xué)電離源(atmospheric-pressure chemical ionization，APCI)時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)較小。同時(shí)，APCI源的靈敏度要高于ESI源，且APCI源更適合一些難離子化的化合物。
APCI離子源在藥物雜質(zhì)檢測中應(yīng)用范圍較廣，常見的化學(xué)藥品(雷尼替丁、二甲雙胍、沙坦類等)中的亞硝胺化合物都可采用APCI離子源檢測。此外，APCI離子源還可用于生物制品中遺傳毒性雜質(zhì)的檢測，Luo等采用鹽析液液萃取(salting-out liquid-liquid extraction，SALLE)前處理技術(shù)建立了SALLE-LC-APCI-MS/MS法測定單克隆抗體中的13種亞硝胺雜質(zhì)的方法。這是首次為生物制藥中亞硝胺遺傳毒性雜質(zhì)的定量提供了一種可靠而靈敏的方法。
表4總結(jié)了上述文獻(xiàn)中亞硝胺類雜質(zhì)LC-MS檢測方法。
綜上所述，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)由于具有靈敏度高等特點(diǎn)，已成為ppm級(jí)別的遺傳毒性雜質(zhì)定量檢測的常用方法。色譜柱多采用C18或苯基柱。APCI源和ESI源均可應(yīng)用于藥物中亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的檢測，但采用APCI源的基質(zhì)效應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)通常低于采用ESI源。
由于遺傳毒性雜質(zhì)含量較低，為了保證較好檢測結(jié)果，往往需要向質(zhì)譜中注入較高濃度的樣品。但是，對(duì)于沒有經(jīng)過前處理的樣品，直接進(jìn)樣會(huì)使高濃度的主成分進(jìn)入離子源，對(duì)質(zhì)譜儀造成污染。因此，可以通過固相萃取(solid phase extraction，SPE)、固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)和分散液-液微萃取等方法或閥切換技術(shù)連接在線樣品處理技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行前處理。
4.1.4 氣相色譜法
雖然質(zhì)譜串聯(lián)熱能分析儀(gas chromatography tandem thermal energy analyzer, GC-TEA)聯(lián)用也可應(yīng)用于遺傳毒性雜質(zhì)的檢測中，但GC-MS更為普遍。
表5總結(jié)了FDA先后建立的直接進(jìn)樣(direct injection, DI)氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(DI-GC-MS)和頂空(headspace, HS)氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(HS-GC-MS)對(duì)沙坦類藥物中亞硝胺類遺傳毒性藥物的檢測方法。
DI-GC-MS精密度較高，重復(fù)性好，適合液體進(jìn)樣，但進(jìn)樣時(shí)可能會(huì)有主成分造成的干擾。目前DI-GC-MS已用于很多藥品(纈沙坦、西洛他唑、蘋果酸舒尼替尼、奧美沙坦酯、阿莫西林等)中遺傳毒性雜質(zhì)的定量檢驗(yàn)。
頂空進(jìn)樣法適合揮發(fā)性較大的雜質(zhì)。該方法將樣品置于頂空瓶中，只抽取樣品中揮發(fā)性氣體進(jìn)行測定，大大減少了樣品基質(zhì)對(duì)被分析物的干擾。同時(shí)，該方法具有無須復(fù)雜的前處理過程且操作簡單的特點(diǎn)。Wichitnitnithad等建立了HS-GC-MS法檢測10批纈沙坦原料藥中遺傳毒性雜質(zhì)含量的方法。Lee等建立了無溶劑(SF)-HS-GC/MS對(duì)原料藥和制劑中NDMA進(jìn)行檢測，與傳統(tǒng)的HS-GC/MS和LC-MS/MS方法相比，該法對(duì)NDMA的快速篩選更加方便，不需要樣品前處理。具有較高的靈敏度和選擇性。
需要注意的是，無論使用直接進(jìn)樣還是頂空進(jìn)樣，GC-MS最大的挑戰(zhàn)在于待測主成分的遺傳毒性雜質(zhì)在高溫下有增加的風(fēng)險(xiǎn)。Lim等建立了一種GC-MS/MS同時(shí)測定沙坦類、二甲雙胍和雷尼替丁等8種藥品中遺傳毒性雜質(zhì)的方法。該方法采用沉淀法和固相萃取法進(jìn)行前處理。該方法在去除藥物和輔料的同時(shí)，NDMA和NDEA得到了有效的回收。是一種方便可行、靈敏度高、專屬性好、準(zhǔn)確性和精密度較高的檢測方法。該法通過前處理除去了主成分，使得雷尼替丁這種受熱易分解的藥物也可用GC-MS/MS法檢測，為此類藥物的檢測提供了可替代的方法。Alshehri等建立了HS-SPME-GC-MS法檢測雷尼替丁中遺傳毒性雜質(zhì)NDMA。該法采用固相微萃取技術(shù)，制備過程簡單，采用低溫從而避免了雷尼替丁受熱分解，可用于其他受熱易分解藥物的遺傳毒性雜質(zhì)檢測。Chang等采用固相萃取前處理法建立了HS-SPME-GC-MS/MS檢測44種藥物中14種亞硝胺的方法。
GC也可與TEA聯(lián)用，但該儀器價(jià)格昂貴，故適用范圍比較小。GC-TEA的原理是熱能分析儀能特異性催化亞硝胺類化合物裂解成一氧化氮(NO)基團(tuán)，與臭氧反應(yīng)后會(huì)產(chǎn)生近紅外光，利用光電倍增管檢測，從而對(duì)亞硝胺類化合物的含量進(jìn)行測定。咸瑞卿等建立了GC-TEA法檢測13批纈沙坦原料藥及其制劑中NDMA含量。GC-TEA法相對(duì)于GC-MS，減少了背景和基質(zhì)干擾，避免了采用GC-MS法時(shí)定性、定量離子保留時(shí)間附近有較多干擾峰的問題，保證了低濃度樣品的定量準(zhǔn)確性。但由于其價(jià)格昂貴，通常不作為亞硝胺類雜質(zhì)的檢測方法。
表6總結(jié)了上述文獻(xiàn)中亞硝胺類雜質(zhì)GC-MS檢測方法。
以上內(nèi)容總結(jié)了近年來氣相色譜串聯(lián)熱能分析儀和質(zhì)譜檢測亞硝胺類遺傳毒性雜質(zhì)的分析方法。GC-MS相對(duì)于LC-MS具有分析速度快、操作簡單、成本低等特點(diǎn)，雖然應(yīng)用范圍較LC-MS窄，主要適用于易揮發(fā)性成分的分離檢測，但也是遺傳毒性雜質(zhì)檢測不可或缺的方法。直接進(jìn)樣法相對(duì)于頂空進(jìn)樣法的靈敏度高，但可能會(huì)有主成分或者輔料等干擾造成的基質(zhì)效應(yīng)，該基質(zhì)效應(yīng)是待測樣品與硅醇基或玻璃襯管表面金屬離子間的相互作用所導(dǎo)致。這些基質(zhì)成分有利于被測樣品轉(zhuǎn)移至檢測器，從而導(dǎo)致較高的分析信號(hào)。因此，GC-MS中的基質(zhì)效應(yīng)更多表現(xiàn)為基質(zhì)誘導(dǎo)增強(qiáng)效應(yīng)，產(chǎn)生假陽性。為了避免這種干擾，要考慮色譜條件和前處理方法的優(yōu)化。選擇合適的內(nèi)標(biāo)可以校正測量過程產(chǎn)生的誤差，是避免基質(zhì)效應(yīng)的有效方法。同位素內(nèi)標(biāo)法常用于計(jì)算檢測結(jié)果。除此之外，還可采用固相萃取法、沉淀法等除去主成分和輔料的干擾。頂空進(jìn)樣收集揮發(fā)性氣體進(jìn)行檢測，操作簡單，無須前處理。同時(shí)結(jié)合固相微萃取技術(shù)，可顯著降低復(fù)雜基質(zhì)的干擾，增加檢測靈敏度，并且適用于受熱不穩(wěn)定樣品的檢測。SPME是一種附加在注射針上的輔助纖維萃取技術(shù)，可用于在樣品分析前提取目標(biāo)分析物。SPME結(jié)合HS-GC-MS法已廣泛應(yīng)用在遺傳毒性雜質(zhì)檢測中。
由于微量水平的遺傳毒性物質(zhì)也會(huì)對(duì)服藥者造成不可逆轉(zhuǎn)的危害，可能會(huì)引發(fā)腫瘤甚至癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，并且其引發(fā)的致癌風(fēng)險(xiǎn)可能與使用的劑量沒有相關(guān)性，存在遺傳毒性化合物在極低劑量水平下導(dǎo)致人體DNA損傷，且該損傷效應(yīng)有通過遺傳物質(zhì)的復(fù)制而不斷放大的風(fēng)險(xiǎn)。因此各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求對(duì)藥品中遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格控制。而對(duì)于制劑中的遺傳毒性雜質(zhì)檢測，由于成分復(fù)雜，制劑中的輔料可能會(huì)引起基質(zhì)效應(yīng)，從而影響遺傳毒性雜質(zhì)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確。目前，多是根據(jù)不同品種、不同生產(chǎn)企業(yè)去建立相應(yīng)的檢測方法，使得監(jiān)管效率降低?？梢試L試通過在線閥切換、固相萃取等方式建立前處理方法，使得檢測方法更有通用性。此外，近年來，隨著各國對(duì)遺傳毒性雜質(zhì)的研究逐漸深入，對(duì)于遺傳毒性雜質(zhì)認(rèn)知也發(fā)生了變化。監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)遺傳毒性雜質(zhì)的控制也更加科學(xué)、合理。生產(chǎn)企業(yè)通過采用“避免-控制-清除”的策略，使實(shí)際工藝中所有可能涉及的遺傳毒性雜質(zhì)風(fēng)險(xiǎn)得到明確鑒別和控制，是達(dá)到監(jiān)管期望的有效途徑。
本文從監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)藥品中遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管策略、遺傳毒性雜質(zhì)來源、檢測方法及清除策略4個(gè)方面進(jìn)行了綜述，為藥品中遺傳毒性雜質(zhì)的控制/清除、檢測提供了參考和依據(jù)。
來源：《中國抗生素雜志》 2024年1月 第49卷第1期
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