眾所周知，藥物進(jìn)入人體試驗(yàn)之前需要開展大量非臨床動(dòng)物研究。各指導(dǎo)原則對(duì)于安全性研究中的動(dòng)物數(shù)量也有明確建議。不過，目前的趨勢(shì)是世界各地監(jiān)管機(jī)構(gòu)或協(xié)會(huì)大都在努力減少動(dòng)物的使用。當(dāng)然，前提是不失其科學(xué)性。比如EMA在Directive 2010/63/EU中，規(guī)定了動(dòng)物的替代（replacement）、減少（reduction）和優(yōu)化（refinement）原則，即著名的“3R”原則，旨在加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物的保護(hù)。FDA也出臺(tái)了Modernization Act 2021，允許使用新的替代方法評(píng)估藥物安全性。
正是基于減少動(dòng)物使用的原則，虛擬對(duì)照（virtual control groups）的概念被引入安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中，并用于取代平行對(duì)照組（concurrent control groups）。所謂的平行對(duì)照組通常指給予稀釋藥物用的溶媒或其它溶劑的陰性對(duì)照組，一般占毒理研究的25%的動(dòng)物數(shù)量。虛擬對(duì)照的依據(jù)則主要來源于歷史對(duì)照數(shù)據(jù)。但是，虛擬對(duì)照的使用是有很大挑戰(zhàn)的，如果試驗(yàn)相關(guān)協(xié)變量不能得到充分控制，有可能對(duì)毒理研究結(jié)果造成影響。
2023年，徠博科（Labcorp）團(tuán)隊(duì)就虛擬對(duì)照替代平行對(duì)照可行性這一主題進(jìn)行了研究。選取了13周和52周重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)作為樣本，因?yàn)檫@個(gè)階段已經(jīng)有了部分人體數(shù)據(jù)，且Vehicle對(duì)照已經(jīng)基本確定。另外，考慮到非人靈長(zhǎng)類（Non-human primates, NHP）的全球短缺，關(guān)注度最高，主要收集的是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的安全性數(shù)據(jù)。調(diào)查之初，研究團(tuán)隊(duì)首先提出了3個(gè)問題：
1）NHP毒理試驗(yàn)中，什么樣的毒理學(xué)終點(diǎn)只有在平行對(duì)照存在的情況才能評(píng)估？
2）如果把平行對(duì)照數(shù)據(jù)從整體試驗(yàn)中移除，會(huì)出現(xiàn)什么樣的挑戰(zhàn)？
3）如果不參照平行對(duì)照數(shù)據(jù)，給藥組的數(shù)據(jù)應(yīng)該如何評(píng)估？
帶著這3個(gè)問題，研究團(tuán)隊(duì)從近3年在徠博科開展的20項(xiàng)NHP研究中收集數(shù)據(jù)，并進(jìn)行了分析。納入的毒理學(xué)參數(shù)包括：臨床觀察、體重、眼科檢查、體溫、血壓、心電圖、尿液分析、血常規(guī)、血生化、凝血、免疫細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子/趨化因子、T細(xì)胞依賴的抗體反應(yīng)（TDAR）、器官重量、大體解剖觀察、組織病理學(xué)檢查等。
20項(xiàng)研究中，有2項(xiàng)未見任何毒理學(xué)異常發(fā)現(xiàn)，予以剔除。剩余18項(xiàng)研究中，有4項(xiàng)出現(xiàn)了供試品相關(guān)的不良反應(yīng)，研究ID分別為F、G、O、Q，如下表所示。
這些供試品相關(guān)的毒性發(fā)現(xiàn)最后均用于NOAEL的判定，那么問題來了，如果不參照平行vehicle對(duì)照數(shù)據(jù)，這些毒性表現(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)嗎？
供試品相關(guān)的不良反應(yīng)
F試驗(yàn)，高劑量3只動(dòng)物在給藥末期的體重與陰性對(duì)照相比，出現(xiàn)降低。不過，如果與藥前值對(duì)比，依然能確定這3只動(dòng)物體重降低。高劑量組雄性動(dòng)物大體解剖和病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)睪丸異常。這些異常通過歷史病理對(duì)照數(shù)據(jù)，依然可以識(shí)別出來。
G試驗(yàn)，高劑量2只動(dòng)物與平行vehicle對(duì)照相比，出現(xiàn)血小板降低。即使沒有平行對(duì)照，該結(jié)果依然可以通過與藥前值、歷史對(duì)照數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)。
O試驗(yàn)，中劑量和高劑量組動(dòng)物發(fā)現(xiàn)睪丸大體解剖和病理學(xué)檢查的異常，其中高劑量的毒性反應(yīng)比之中劑量更為嚴(yán)重。不過，即使沒有平行對(duì)照，這些異常通過歷史病理對(duì)照數(shù)據(jù)也可以進(jìn)行判斷。
Q試驗(yàn)，與平行vehicle對(duì)照相比，高劑量組動(dòng)物谷氨酸脫氫酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶升高。即使沒有平行對(duì)照，以上毒理學(xué)發(fā)現(xiàn)，依然可以通過藥前值和歷史對(duì)照數(shù)據(jù)識(shí)別出來。而且，病理發(fā)現(xiàn)這些動(dòng)物同時(shí)伴有肝內(nèi)膽管肥大和增生，也可以輔助判斷。
以上介紹了供試品相關(guān)的不良反應(yīng)，再看下供試品相關(guān)的非不良反應(yīng)判定情況。
18項(xiàng)研究中，如果不參照平行對(duì)照組數(shù)據(jù)，大部分的非不良反應(yīng)依然可以檢出。只有器官重量改變、TDAR是例外的。
F試驗(yàn)，高劑量組的肝臟、脾臟重量與陰性對(duì)照相比是升高的。不過，由于未在鏡檢中發(fā)現(xiàn)與器官重量增加相關(guān)的異常，未被視為不良反應(yīng)。如果沒有平行陰性對(duì)照，只能與歷史對(duì)照組數(shù)據(jù)比對(duì)，但未獲得充分的器官重量歷史對(duì)照數(shù)據(jù)。I和P研究中也遇到了同樣的問題。
TDAR主要用于檢測(cè)免疫功能包括抗原攝取、遞呈、輔助性T細(xì)胞功能、B細(xì)胞激活和抗體產(chǎn)生。通過采用標(biāo)準(zhǔn)抗原如KLH進(jìn)行免疫，然后檢測(cè)免疫球蛋白IgM、IgG。B研究中，與平行陰性對(duì)照相比，給藥組免疫后的IgG水平下降，考慮到與供試品的作用機(jī)制相關(guān)，未被定為不良反應(yīng)。如果不參照平行對(duì)照數(shù)據(jù)，TDAR的異常結(jié)果無法判定。這點(diǎn)在H、M、S研究中同樣存在。
Vehicle或操作引起的毒性表現(xiàn)
F試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照3只雄性動(dòng)物、中劑量1只雄性動(dòng)物、高劑量4雄3雌出現(xiàn)嘔吐，考慮到平行陰性對(duì)照也有同樣發(fā)現(xiàn)，嘔吐判定為vehicle相關(guān)的。而嘔吐這類反應(yīng)是沒有歷史對(duì)照數(shù)據(jù)的，如果沒有平行對(duì)照，本試驗(yàn)中的嘔吐原因是無法解釋的。F試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)雄性動(dòng)物（包括陰性對(duì)照）收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓輕度降低，最后判定為頻繁操作引起，動(dòng)物適應(yīng)操作后有所好轉(zhuǎn)。如果沒有平行對(duì)照，這一心血管發(fā)現(xiàn)可能會(huì)歸類為供試品相關(guān)。
I試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白濃度下降，鑒于陰性組有同樣發(fā)現(xiàn)，最后判定為毒代動(dòng)力學(xué)頻繁采血所致。如果無平行對(duì)照，很難定性這一異常與頻繁操作有關(guān)。
Q試驗(yàn)中，幾乎所有的動(dòng)物（包括vehicle對(duì)照組）均出現(xiàn)體重降低，4周后體重趨于穩(wěn)定，并在隨后幾周體重恢復(fù)增長(zhǎng)。最后將這一異常歸因于每天2次的頻繁操作導(dǎo)致的動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)。如果未設(shè)置vehicle對(duì)照組，體重下降可能會(huì)被認(rèn)為與供試品相關(guān)。同理，該試驗(yàn)中所有組動(dòng)物均出現(xiàn)白蛋白降低，也是需要借助平行陰性對(duì)照進(jìn)行析因。
偶發(fā)毒性發(fā)現(xiàn)
有些毒性發(fā)現(xiàn)既不是vehicle相關(guān)的，也不是頻繁的動(dòng)物操作所致。比如H試驗(yàn)可見動(dòng)物皮膚變色，平行設(shè)置的vehicle對(duì)照組和給藥組均有發(fā)現(xiàn)，故不認(rèn)為是供試品相關(guān)的，因不影響動(dòng)物整體健康狀態(tài)，具體發(fā)生原因也未做明確歸因。如果未設(shè)置vehicle對(duì)照，這一結(jié)果的解釋就要困難很多。同理，P試驗(yàn)中可見vehicle對(duì)照組和給藥組一過性軟便，也是需要參照vehicle數(shù)據(jù)查找原因。
移除平行對(duì)照數(shù)據(jù)后的統(tǒng)計(jì)分析
雖然重復(fù)給藥的樣本量較小，對(duì)于一些程度較輕的毒性變化，統(tǒng)計(jì)效力往往是不夠的。但無論ICH，還是OECD相關(guān)指導(dǎo)原則，依然建議采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行毒理學(xué)分析。常用的統(tǒng)計(jì)方法是先進(jìn)行fix-effect ANOVA，再采用Dunnett’s test進(jìn)行組間成對(duì)分析。假如去掉平行對(duì)照數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，比如與藥前值進(jìn)行對(duì)比，則建議采用mixed-design ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用fix-effect ANOVA/Dunnett’s test統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)的22個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的指標(biāo)，82%可以通過mixed-design ANOVA檢出，18%不能檢出的原因與指標(biāo)變化程度輕且伴隨個(gè)體間高度變異等有關(guān)。
總結(jié)
1）供試品相關(guān)的不良反應(yīng)：供試品相關(guān)的不良反應(yīng)對(duì)于NOAEL的確定非常關(guān)鍵。4項(xiàng)發(fā)現(xiàn)供試品相關(guān)不良反應(yīng)的研究中，即使沒有平行陰性對(duì)照，通過藥前值或者歷史對(duì)照數(shù)據(jù)，依然可以準(zhǔn)確獲得NOAEL。
2）供試品相關(guān)的非不良反應(yīng)：很多供試品相關(guān)的效應(yīng)是non-adverse的，人體風(fēng)險(xiǎn)低，也不影響NOAEL的確定。絕大多數(shù)的non-adverse反應(yīng)在沒有平行陰性對(duì)照的情況下，依然是可以檢出的。當(dāng)然，器官重量和TDAR例外。
3）Vehicle或操作引起的異常發(fā)現(xiàn)：很多動(dòng)物的指標(biāo)異常在vehicle對(duì)照可同時(shí)發(fā)現(xiàn)，或與操作導(dǎo)致的動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，或與過度采血有關(guān)，亦或者其它可能原因。如果去掉對(duì)照組，對(duì)于這些反應(yīng)的歸因可能會(huì)存在挑戰(zhàn)。不過，徠博科研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，這些異常情況并不罕見，已經(jīng)有足夠經(jīng)驗(yàn)幫助判斷，即使沒有平行設(shè)置的陰性對(duì)照，也可以對(duì)Vehicle或操作引起的異常數(shù)據(jù)進(jìn)行解釋。
4）偶發(fā)性毒性：其實(shí)，平行設(shè)置陰性對(duì)照組最主要的一個(gè)原因是用于解釋一些不可控的偶發(fā)性的異常指標(biāo)。比如文中提及的動(dòng)物皮膚異?；蛘哕洷闱闆r。離開平行對(duì)照，這類終點(diǎn)的解讀會(huì)有些難度。當(dāng)然，徠博科團(tuán)隊(duì)依然認(rèn)為如果積累足夠多的歷史對(duì)照數(shù)據(jù)，這些情況也是可以解決的。
總之，考慮到涉及NOAEL制定的供試品相關(guān)的不良反應(yīng)、絕大多數(shù)供試品相關(guān)的非不良反應(yīng)均可以通過虛擬對(duì)照達(dá)到目的，徠博科這篇文章的結(jié)論是regulatory(sub)chronic NHP toxicity studies represent a good starting point to implement virtual control groups–rather than concurrent control groups—in nonclinical safety testing，即采用虛擬對(duì)照對(duì)于NHP重復(fù)給藥毒性研究是可行的。
當(dāng)然，本文并不是鼓勵(lì)NHP一般毒理研究中不設(shè)置vehicle對(duì)照，相反，這種方案設(shè)計(jì)，個(gè)人理解，幾乎百分百會(huì)被監(jiān)管機(jī)構(gòu)退回，起碼現(xiàn)階段應(yīng)該是這樣的。
不過，減少動(dòng)物的使用是大趨勢(shì)，徠博科團(tuán)隊(duì)的這項(xiàng)前瞻性研究是很有意義的，但這項(xiàng)結(jié)論成立是有前提的。首先，樣本量太少，僅回溯20項(xiàng)研究得出的結(jié)論有一定代表性，但不一定絕對(duì)客觀，也不宜過度解讀。其次，即使這項(xiàng)結(jié)論客觀，還是有一些毒性發(fā)現(xiàn)比如vehicle導(dǎo)致的，更別提很多新藥采用的vehicle溶媒并不普遍，沒太多背景數(shù)據(jù)可參考。缺少平行陰性對(duì)照，使得很多毒性終點(diǎn)的判定頗具挑戰(zhàn)。最后，歷史對(duì)照數(shù)據(jù)是可以很大程度上作為虛擬對(duì)照數(shù)據(jù)，用于彌補(bǔ)平行對(duì)照缺失引發(fā)的問題，但這里面同樣有問題，一是國(guó)內(nèi)有多少機(jī)構(gòu)有歷史對(duì)照數(shù)據(jù)積累，二是歷史對(duì)照數(shù)據(jù)是否可靠（對(duì)質(zhì)量體系的考驗(yàn)），三是歷史對(duì)照數(shù)據(jù)是否足夠多（對(duì)項(xiàng)目數(shù)量的考驗(yàn)），四是歷史對(duì)照數(shù)據(jù)是否全面，是否囊括了大部分毒理學(xué)指標(biāo)。藥前值數(shù)據(jù)就更不必說了，對(duì)于一次性的數(shù)據(jù)比如器官重量、病理等的解釋是愛莫能助的，還涉及一些統(tǒng)計(jì)效力問題。
作為藥理毒理研究大軍的一份子，我們保留對(duì)現(xiàn)有監(jiān)管尺度和原則認(rèn)知的同時(shí)，也需要捕捉國(guó)際同行對(duì)個(gè)別問題理解的變化。有挑戰(zhàn)并不可怕，問題終究是用來解決的，對(duì)歷史對(duì)照數(shù)據(jù)的充分重視其實(shí)就是個(gè)不錯(cuò)的起點(diǎn)。
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