據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)是馬鈴薯種植面積最大的國(guó)家，種植面積穩(wěn)定在8000萬(wàn)畝以上，全國(guó)馬鈴薯鮮薯產(chǎn)量達(dá)一億噸。在馬鈴薯貯藏過(guò)程中為防止其發(fā)芽、變綠，常在馬鈴薯收獲的前2~4周內(nèi)，用 0.2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù) )馬來(lái)酰肼(MH)溶液進(jìn)行葉面噴灑。MH又名抑芽丹，是一種植物生長(zhǎng)抑制劑，能有效抑制植株頂端分生組織細(xì)胞分裂，破壞植株頂端優(yōu)勢(shì)，強(qiáng)烈抑制芽的生長(zhǎng)，常被用于抑制馬鈴薯、洋蔥、大蒜等蔬菜貯藏期的發(fā)芽。研究發(fā)現(xiàn)，MH是一種誘變致癌劑，一定劑量下會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞染色體斷裂，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性，對(duì)人和高等動(dòng)物有潛在風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)中國(guó)馬鈴薯協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)人均食用馬鈴薯消費(fèi)量為31.3kg·a-1，日均消費(fèi)量為85.75g·d-1。因此，建立馬鈴薯中 MH殘留的簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法已成為保障人民身體健康的迫切需求。
目前，MH殘留的檢測(cè)方法主要有蒸餾-分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、拉曼光譜法、化學(xué)發(fā)光法、差分脈沖伏安法等。較為常見的是前3種方法，其中蒸餾-分光光度法是美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)最初采用的方法，其依賴MH在濃堿及高溫條件下被鋅還原成肼，同時(shí)用氮?dú)獗Ｗo(hù)，將生成的肼蒸餾出來(lái)，在酸性溶液中與對(duì)二甲基氨基苯甲醛反應(yīng)生成黃色化合物，再用分光光度法進(jìn)行檢測(cè)。該過(guò)程需要濃堿、高溫條件，以及蒸餾等步驟，前處理復(fù)雜，操作繁瑣，導(dǎo)致方法重復(fù)性不好。HPLC檢測(cè)靈敏度較差，若想達(dá)到較低的檢出限，則需要濃縮、復(fù)溶等一系列復(fù)雜的前處理手段。LC-MS/MS檢測(cè)MH雖有較高的靈敏度，但儀器成本高，難以作為常規(guī)檢測(cè)手段。根據(jù)MH的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它在弱酸性、堿性條件下呈陰離子狀態(tài)，并且具有紫外吸收，因此可采用帶有紫外檢測(cè)器的離子色譜法進(jìn)行分析檢測(cè)。
鑒于此，研究人員提出了離子交換色譜-紫外檢測(cè)器法測(cè)定馬鈴薯中MH殘留量的方法。相較于蒸餾-分光光度法、HPLC等傳統(tǒng)檢測(cè)方法，該方法前處理簡(jiǎn)單，更易于推廣為常規(guī)檢測(cè)方法；相較于離子排斥色譜法，該方法更加通用，同時(shí)流動(dòng)相避免了有機(jī)溶劑的引入，符合綠色環(huán)保的理念，且流動(dòng)相由KOH淋洗液發(fā)生器在線產(chǎn)生，不僅基線噪聲更低，還避免了手動(dòng)配制流動(dòng)相產(chǎn)生的誤差及二氧化碳的影響，有效提高了方法的精密度和穩(wěn)定性。
1、試驗(yàn)方法
本文分析的市售馬鈴薯均未檢出 MH，因此將馬鈴薯浸泡在MH標(biāo)準(zhǔn)溶液中可簡(jiǎn)單模擬MH殘留的馬鈴薯樣品。將馬鈴薯洗凈，切成厚片，浸泡于500mg·L-1MH標(biāo)準(zhǔn)溶液中，再置于2~8℃冰箱中放置24h。24h后取出，洗凈、去皮、攪碎。稱取樣品處理后的樣品于離心管中，加入甲醇，超聲，每隔5min振搖1次，使樣品分散均勻，然后于60℃水浴加熱，室溫下離心，上清液過(guò)0.22μm聚醚砜針式濾器和IC-RP反相前處理柱，濾液按照儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。
2、結(jié)果與討論
2.1 提取溶劑的選擇
試驗(yàn)采用陰離子交換色譜柱，流動(dòng)相為堿性溶液，若提取溶劑選擇不當(dāng)，不僅會(huì)影響提取效率，還會(huì)影響待測(cè)物的保留時(shí)間和檢測(cè)結(jié)果。試驗(yàn)考察了含20mmol·L-1氫氧化鈉的甲醇溶液、20mmol·L-1氫氧化鈉溶液、水以及甲醇分別作為提取溶劑時(shí)模擬馬鈴薯樣品中MH的測(cè)定值，結(jié)果如圖1所示。
由圖1可知，以甲醇和含20 mmol·L-1氫氧化鈉的甲醇 溶 液 為 提 取溶劑時(shí)，MH測(cè)定值分別為44.19μg·g-1和45.37μg·g-1，略高于以20mmol·L-1氫氧化鈉溶液和水為提取溶劑時(shí)的(MH測(cè)定值分別為36.23μg·g-1和34.90μg·g-1)?？紤]到加入堿會(huì)影響溶液酸度，從而影響待測(cè)物的出峰時(shí)間，試驗(yàn)選擇以甲醇為馬鈴薯中MH的提取溶劑。
2.2 儀器工作條件的選擇
2.2.1 淋洗液發(fā)生器的使用
陰離子交換色譜柱的流動(dòng)相可通過(guò) KOH淋洗液發(fā)生器在線產(chǎn)生，也可用手動(dòng)配制的NaOH溶液。試驗(yàn)考察了這兩種方式的流動(dòng)相對(duì)MH檢測(cè)的影響，淋洗液發(fā)生器采用的流動(dòng)相為3mmol·L-1KOH 溶液，手動(dòng)配制的流動(dòng)相為3mmol·L-1NaOH溶液，結(jié)果如圖2所示。
結(jié)果表明，采用KOH淋洗液發(fā)生器的基線噪聲比采用手動(dòng)配制NaOH溶液的小。這是由于NaOH溶液在手動(dòng)配制過(guò)程中會(huì)吸收空氣中二氧化碳，對(duì)基線造成一定的影響，而淋洗液發(fā)生器可實(shí)時(shí)制備出較為純凈的KOH溶液，避免了雜質(zhì)干擾。因此，試驗(yàn)采用KOH淋洗液發(fā)生器提供流動(dòng)相。
2.2.2 色譜柱
試驗(yàn)考察了Dionex IonPac AS11-HC和AG11-HC、Dionex IonPac AS15和AG15、Dionex IonPac AS16和AG16、Dionex IonPac AS18 和AG18以及 Dionex IonPac AS19和AG19等5種色譜柱(前者為分析柱，后者為保護(hù)柱)對(duì)模擬馬鈴薯樣品中MH色譜峰的影響，結(jié)果見圖3。
結(jié)果表明：采用Dionex IonPac AS11-HC和AG11-HC 色譜柱分離時(shí)(流動(dòng)相為1mmol·L-1KOH溶液)，基線不穩(wěn)定，且MH出峰前出現(xiàn)保留時(shí)間為12.75min的未知峰(由于含量太少，圖中未能顯示)，與MH的分離度為1.22，小于1.5，不適用于MH的分離檢測(cè)；采 用Dionex IonPac AS19和AG19色譜柱分離時(shí)(流動(dòng)相為5mmol·L-1KOH溶液)，MH顯示為倒峰，可能是由于模擬樣品中有其他物質(zhì)與MH在同一位置出峰，且在205nm 檢測(cè)波長(zhǎng)下的吸光度比基線小，不宜用于MH的檢測(cè)；Dionex IonPac AS15 和AG15 (流動(dòng)相為10mmol·L-1KOH 溶液)、Dionex IonPac AS16和AG16(流動(dòng)相為3mmol·L-1KOH溶液)、Dionex IonPac AS18和 AG18(流動(dòng)相為5mmol·L-1KOH溶液)色譜柱均可較好地分離MH，但Dionex IonPac AS16和AG16色譜柱得到的MH色譜峰峰高相對(duì)較高，半峰寬相對(duì)較小,對(duì)稱性較好。因此，試驗(yàn)選用Dionex IonPac AS16和AG16 色譜柱進(jìn)行檢測(cè)。
2.2.3 洗脫程序
試驗(yàn)考察了KOH溶液濃度分別為3，4，5mmol·L-1時(shí)模擬馬鈴薯樣品中MH的分離情況，結(jié)果見圖4。
結(jié)果表明，當(dāng)KOH溶液濃度由5mmol·L-1降低至3mmol·L-1時(shí)，MH 色譜峰與前面未知峰的分離度逐漸增加，其中3，4mmol·L-1KOH溶液得到的MH分離度(1.99，1.68)均滿足大于1.5的要求。鑒于3mmol·L-1KOH溶液得到的MH分離度更好，且保留時(shí)間也比較合理，試驗(yàn)選擇以3mmol·L-1 KOH溶液分離MH。MH洗脫分離后，立即將KOH溶液濃度升至30 mmol·L-1來(lái)沖洗雜質(zhì)，最后再將KOH溶液濃度降至3mmol·L-1平衡系統(tǒng)。
2.3 系統(tǒng)適用性
按照儀器工作條件分別對(duì)空白溶液、未浸泡MH的樣品溶液以及2.028mg·L-1MH 標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，考察MH的干擾情況，結(jié)果見圖5。
由圖5可知，空白溶液和未浸泡MH 的樣品溶液中均未出現(xiàn)干擾MH的物質(zhì)，說(shuō)明該方法對(duì)馬鈴薯中MH的檢測(cè)不存在干擾。
2.4 方法學(xué)驗(yàn)證
2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限
取10，20，50，80，100μL1014mg·L-1MH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用水定容至10mL，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為1.014，2.028，5.070，8.112，10.14mg·L-1的MH標(biāo)準(zhǔn)溶液系列；分取360μL5.070mg·L-1MH標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水定容至10mL，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1825mg·L-1的 MH標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照儀器工作條件對(duì)上述6個(gè)濃度水平的MH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以MH質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明：MH標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=2.194x-0.06424，相關(guān)系數(shù)為0.9999，線性范圍為0.1825~10.14mg·L-1。
分別以3，10倍信噪比(S/N)確定檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N)，結(jié)果分別為0.06mg·L-1和0.18mg·L-1。
2.4.2 儀器精密度和重復(fù)性試驗(yàn)
將2.028mg·L-1MH標(biāo)準(zhǔn)溶液按照儀器工作條件測(cè)定6次，結(jié)果顯示，MH的保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.073%，3.7%，表明儀器穩(wěn)定，精密度較好。
取同一模擬馬鈴薯樣品，按照試驗(yàn)方法平行處理6份并測(cè)定，結(jié)果顯示，MH的保留時(shí)間、測(cè)定值和峰面積的 RSD分別為0.15%，3.8%，3.4%，表明本方法重復(fù)性較好。
2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)
將2.082mg·L-1MH標(biāo)準(zhǔn)溶液及模擬馬鈴薯樣品溶液在室溫下放置，于 0，6，12，18，24h分別進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示：標(biāo)準(zhǔn)溶液中MH的保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為1.6%，2.2%，模擬馬鈴薯樣品溶液中MH的保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為1.3%，1.8%，說(shuō)明24h內(nèi)MH的穩(wěn)定性良好。
2.4.4 耐用性試驗(yàn)
試驗(yàn)考察了柱溫、流量和檢測(cè)波長(zhǎng)這3個(gè)參數(shù)的耐用性。
改變柱溫為28℃和32℃，其他條件不變，對(duì)2.082mg·L-1MH標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定6次，對(duì)模擬馬鈴薯樣品溶液測(cè)定1次。結(jié)果表明：當(dāng)柱溫為28，32℃時(shí)，MH色譜峰與未知峰的分離度分別為1.91和2.10，均滿足分離度大于1.5的要求；6次測(cè)定的MH峰面積的RSD 分別為4.0%和4.4%，精密度較好，說(shuō)明柱溫為(30±2)℃時(shí)對(duì)MH的檢測(cè)沒(méi)有影響。
改變流量為0.9 mL·min-1和1.1mL·min-1，其他條件不變，對(duì)2.082mg·L-1MH標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定6次，對(duì)模擬馬鈴薯樣品溶液測(cè)定1次。結(jié)果表明：當(dāng)流量為0.9，1.1mL·min-1時(shí)，MH色譜峰與未知峰的分離度分別為1.95和2.03，均滿足分離度大于1.5的要求；6次測(cè)定的MH峰面積的RSD分別為3.1%和4.1%，精密度較好，說(shuō)明流量為(1.0±0.1)mL·min-1時(shí)對(duì)MH 的檢測(cè)沒(méi)有影響。
改變檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm和207nm，其他條件不變，對(duì)2.082mg·L-1MH標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定6次，對(duì)模擬馬鈴薯樣品溶液測(cè)定1次。結(jié)果表明：當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為203，207nm 時(shí)，MH色譜峰與未知峰的分離度分別為1.97和2.00，均滿足分離度大于1.5的要求；6次測(cè)定的MH峰面積的RSD分別為4.1%和2.3%，精密度較好，說(shuō)明檢測(cè)波長(zhǎng)為(205±2)nm時(shí)對(duì)MH的檢測(cè)沒(méi)有影響。
2.4.5 回收試驗(yàn)
在模擬馬鈴薯樣品中加入MH本底值80%，100%，120% 的 MH 標(biāo) 準(zhǔn) 品,即 分 別 加 入 22，28，33μL1014mg·L-1MH標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，每個(gè)濃度水平平行加標(biāo)3次，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行處理和測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果如表1所示。
表1 回收試驗(yàn)結(jié)果
由表1可知：MH回收率為97.9%~108%，表明本方法的準(zhǔn)確度較高。
2.5 樣品分析
隨機(jī)從4個(gè)商家購(gòu)買4 份馬鈴薯樣品，按照試驗(yàn)方法分析其中MH的殘留情況。結(jié)果顯示，馬鈴薯樣品中均未檢出MH(殘留量均低于檢出限)，遠(yuǎn)低于GB 2763-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定的馬鈴薯中 MH 的最大殘留量(50μg·g-1)。
3、試驗(yàn)總結(jié)
本文提出了離子交換色譜-紫外檢測(cè)器法測(cè)定馬鈴薯中MH殘留量的方法，該方法分析快速，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好，可作為馬鈴薯中MH殘留檢測(cè)的通用方法，并可推廣到其他農(nóng)產(chǎn)品如大蒜、洋蔥中MH的檢測(cè)和質(zhì)量控制。
作者：王曉威，孟玲玲，蔡丹旎，于世強(qiáng)，劉鵬宇，欒紹嶸
單位：華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院
來(lái)源：《理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)》2024年第1期
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