1. 介紹
要說起實(shí)驗(yàn)室中最令人頭痛不已的事情，檢測結(jié)果超標(biāo)（Out of specification，OOS）絕對可以排上前幾名。一些國家的藥品監(jiān)管部門及國際組織也發(fā)布了關(guān)于OOS調(diào)查的指南或指導(dǎo)原則。對中國企業(yè)來說，主要參考原CFDA藥品認(rèn)證管理中心編寫的《藥品GMP指南——質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室與物料系統(tǒng)》、美國FDA頒布的藥品超標(biāo)結(jié)果調(diào)查指南及英國藥品監(jiān)督管理局頒布的超標(biāo)與超常結(jié)果調(diào)查指南[1]。在GMP審計(jì)中OOS也是必查項(xiàng)目，同時(shí)也是容易被落缺陷的項(xiàng)目。在2017年及2018年國家核查中心開展的600余次跟蹤檢查中，涉及超標(biāo)與超常結(jié)果調(diào)查的缺陷共74條[1]。而如果OOS中無效OOS的數(shù)量過多，則有可能被認(rèn)為質(zhì)量管理體系存在缺陷，或者實(shí)驗(yàn)室的檢測能力會被受到質(zhì)疑。因此，本文將對容易導(dǎo)致無效OOS發(fā)生的情況進(jìn)行分析，以期對各位同仁有所幫助。本文為筆者經(jīng)驗(yàn)之談，如存在不當(dāng)之處，還請各位同仁予以指正。
2. 無效OOS情況分析
無效OOS是指因檢驗(yàn)過程中的過失而導(dǎo)致的超標(biāo)情況。因此本文將按照樣品檢驗(yàn)流程以HPLC方法檢測為例進(jìn)行討論，如下圖：
2.1實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
方法培訓(xùn)
檢驗(yàn)方法于實(shí)驗(yàn)員而言，如同武林高手的“修煉秘籍”，如果修煉錯(cuò)誤，輕則損傷靜脈，重則走火入魔。方法需要盡可能的熟悉，尤其對特意的注意事項(xiàng)，例如，溶液制備過程是否需要避光，是否需要低溫保存，配制后是否需要立即進(jìn)樣，色譜柱是否需要特殊處理，要對計(jì)算公式有深刻的理解，外標(biāo)法，還是內(nèi)標(biāo)法，還是標(biāo)準(zhǔn)加入方法等，計(jì)算時(shí)分子量以及純度的折算，校正因子的代入，以上都是我們平常實(shí)驗(yàn)時(shí)容易被忽略的地方，進(jìn)而導(dǎo)致了OOS的發(fā)生。因此在方法培訓(xùn)時(shí)，尤其是首次接觸方法的實(shí)驗(yàn)人員，主管或者有經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)員有義務(wù)對實(shí)驗(yàn)員進(jìn)行充分的指導(dǎo)。如有可能可以采用固定的檢測項(xiàng)目由固定人員完成[2]。
物料準(zhǔn)備
樣品應(yīng)該按照規(guī)定的條件進(jìn)行貯存，實(shí)驗(yàn)前在樣品管理員處領(lǐng)取，領(lǐng)取時(shí)應(yīng)注意觀察樣品的性狀是否符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，有的樣品需要避光，有的需要低溫，有的需要冷凍，我們需要對這些情況進(jìn)行逐一核實(shí)，樣品稱量或移取后，因按照規(guī)定貯存，避免變質(zhì)。對照品也應(yīng)進(jìn)行一些的核查，尤其是有效期、純度以及用途（定性或者定量）。
儀器準(zhǔn)備
天平以及pH計(jì)需要進(jìn)行日常校準(zhǔn)，以保證其運(yùn)行狀態(tài)正常。HPLC在實(shí)驗(yàn)前，需要對管路，進(jìn)樣針和泵密封進(jìn)行充分的沖洗，沖洗時(shí)應(yīng)注意管路內(nèi)儲存是什么溶液，以及正反相的切換，沖洗時(shí)應(yīng)不定時(shí)的關(guān)注儀器的壓力狀態(tài)，壓力過高或者過低都是液相色譜儀最為常見的一種問題[3]。日常實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)對HPLC在運(yùn)行純有機(jī)溶劑或者水與有機(jī)溶劑混合溶液時(shí)進(jìn)行觀察，每次壓力不應(yīng)存在較大差異，如差異過大則代表儀器可能存在故障。儀器沖洗完成后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇合適的溶劑對色譜柱進(jìn)行解封沖洗，例如氨基柱對水敏感，則不應(yīng)使用水相比例過高的溶劑。
2.2實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)
流動相制備
流動相制備時(shí)應(yīng)注意所使用的試劑級別是否符合實(shí)驗(yàn)的需求，HPLC的有機(jī)溶劑和水應(yīng)當(dāng)使用色譜級別，緩沖鹽以及pH調(diào)節(jié)劑應(yīng)至少為分析純，因?yàn)橛械牧鲃酉嘤袡C(jī)溶劑較高，同時(shí)緩沖鹽的濃度加大，所以配制時(shí)，應(yīng)將有機(jī)溶劑緩慢倒入置緩沖鹽溶液中，如果反之，則容易出現(xiàn)緩沖鹽析出的情況。如果保留時(shí)間對有機(jī)溶劑比較敏感，則注意使用的量筒規(guī)格，保證可以準(zhǔn)確制備。pH調(diào)節(jié)時(shí)，應(yīng)注意溫度的影響。流動相在過濾時(shí)應(yīng)舍棄初濾液，以避免濾膜存在干擾物質(zhì)，有機(jī)溶劑應(yīng)使用0.45μm的有機(jī)系濾膜，UPLC則應(yīng)使用0.22μm的濾膜。如果緩沖鹽與有機(jī)相混合后，過濾時(shí)間較長可能會導(dǎo)致有機(jī)相揮發(fā)，此時(shí)建議采用水系濾膜對緩沖鹽溶液過濾后再與有機(jī)溶劑混合，然后超聲進(jìn)行脫氣。
溶液制備
樣品在稱量時(shí)，應(yīng)避免陽性對照品與樣品之間的交叉污染，應(yīng)分次稱量。冷藏和冷凍的樣品應(yīng)放置室溫后進(jìn)行稱量，避免溫度偏低對稱量造成影響。稱量液體的樣品時(shí)，天平不易穩(wěn)定，建議采用減重法稱量或者用稱量舟直接稱量。稱量時(shí)也應(yīng)結(jié)合樣品的特性，如吸潮，則應(yīng)盡可能快的稱量，并控制天平室的濕度；如需避光，則需要在避光情況下（如開啟黃光燈）進(jìn)行稱量[4]。稱量后轉(zhuǎn)移時(shí)，應(yīng)對稱量的器具進(jìn)行充分的潤洗，使樣品全部轉(zhuǎn)移至量瓶中。樣品如果需要超聲，按照方法設(shè)定超聲的時(shí)間，超聲結(jié)束后，溶液放置室溫后再進(jìn)行定容。尤其是進(jìn)行固體制劑的樣品制備，由于超聲時(shí)間長，所以溶液溫度高，導(dǎo)致體積膨脹，此時(shí)定容的話，結(jié)果會有非常大的偏差。溶液制備時(shí)需要選擇合適的移液管，避免誤差過大，如果溶液較為粘稠，應(yīng)使溶液緩慢下放，避免溶液掛壁，使移取量偏低。最后進(jìn)行充分勻混后，倒入HPLC小瓶中。因液相的取樣針并不能完全插入HPLC小瓶底部，所以HPLC小瓶中樣品溶液裝入1.5ml為宜，如果進(jìn)樣次數(shù)較多，應(yīng)注意溶液量是否充足。如果溶劑為高比例有機(jī)溶劑時(shí)，單個(gè)HPLC小瓶多次重復(fù)進(jìn)樣，容易出現(xiàn)溶劑揮發(fā)導(dǎo)致峰面積變大。
序列運(yùn)行
在使用流動相對系統(tǒng)和色譜柱充分平衡后，按照方法進(jìn)行序列編輯并進(jìn)樣測定，序列編輯后應(yīng)有第二名實(shí)驗(yàn)員對儀器參數(shù)和序列中溶液名稱以及HPLC小瓶位置進(jìn)行復(fù)核，序列運(yùn)行后，應(yīng)對系統(tǒng)適用性進(jìn)行著重關(guān)注，例如進(jìn)樣重復(fù)性，主峰理論板數(shù)，拖尾因子或分離度等。此外，因隨著色譜柱使用時(shí)間的增加，柱效會逐漸下降，污染導(dǎo)致壓力升高。如果使用含有緩沖鹽的流動相，需特別注意與有機(jī)相兼容情況。色譜柱一般保存在有機(jī)相中，因此每次開始實(shí)驗(yàn)前必須先用高比例純水相沖洗一段時(shí)間色譜柱，再使用緩沖鹽流動相平衡；分析結(jié)束后同樣先用高比例純水相沖洗一段時(shí)間替換色譜柱中的緩沖鹽，再使用有機(jī)相沖洗色譜柱[5]。
2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告
圖譜處理
序列運(yùn)行完成后，按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范為色譜圖建立合適的積分方法并對圖譜進(jìn)行積分，圖譜應(yīng)打印儀器方法，積分方法，序列表以及審計(jì)追蹤便于追溯。圖譜報(bào)告的設(shè)計(jì)應(yīng)包含關(guān)鍵性的信息，例如樣品名稱，進(jìn)樣序列名稱，儀器方法名稱，積分方法名稱，進(jìn)樣時(shí)間，保留時(shí)間，理論板數(shù)，拖尾因子，分離度等參數(shù)。圖譜的標(biāo)尺應(yīng)設(shè)置合理，含量滿量程即可，有關(guān)物質(zhì)可根據(jù)限度水平的對照溶液進(jìn)行設(shè)計(jì)，按對照溶液占量程10%-20%設(shè)計(jì)或其他合理的范圍。
實(shí)驗(yàn)記錄
實(shí)驗(yàn)記錄應(yīng)對實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行及時(shí)的記錄，在記錄過程中也是對實(shí)驗(yàn)過程的復(fù)核，如果存在使用或者操作錯(cuò)誤，也可以被以及發(fā)現(xiàn)。記錄應(yīng)當(dāng)模板話，設(shè)計(jì)應(yīng)簡單明了，既可以保證實(shí)驗(yàn)的效率，又能保證完成記錄的質(zhì)量。計(jì)算時(shí)，應(yīng)使用經(jīng)驗(yàn)證的表格，可及時(shí)準(zhǔn)確的判斷結(jié)果。未經(jīng)驗(yàn)證且未鎖定的表格，出現(xiàn)計(jì)算錯(cuò)誤的概率極大，有的計(jì)算公式非常繁瑣，不易被發(fā)現(xiàn)問題，很容易導(dǎo)致結(jié)果的誤判，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的復(fù)核也存在極大的挑戰(zhàn)。所以表格的驗(yàn)證是件一勞永逸的事情。
結(jié)果報(bào)告
最終結(jié)果的報(bào)告，應(yīng)當(dāng)按照與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一致，如含量結(jié)果要求在95.0-105.0%之間，則報(bào)告值應(yīng)當(dāng)保留一位小數(shù)。計(jì)算有關(guān)物質(zhì)時(shí)，應(yīng)注意報(bào)告限以下不參與總雜質(zhì)的計(jì)算。
3. 總結(jié)
實(shí)驗(yàn)室的工作的主體脈絡(luò)是清晰的，但到具體到工作細(xì)節(jié)末支上，給我們的感覺又雜又亂，所以我們要在整體上有一個(gè)清晰的認(rèn)識，再對枝節(jié)上進(jìn)行豐富自己的知識，這樣的話，我們對實(shí)驗(yàn)的把控就會更加到位，更容易順利的完成每一次實(shí)驗(yàn)，遠(yuǎn)離無效OOS。期待本文對您有所幫助！
參考文獻(xiàn)：
1. 藥品超標(biāo)與超常結(jié)果調(diào)查處理_顏若曦
2. 降低實(shí)驗(yàn)室OOS的發(fā)生率_周金龍
3. 淺析檢定液相色譜儀應(yīng)注意的問題_韓學(xué)東
4. 藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)不合格結(jié)果調(diào)查的實(shí)踐與探討_賈瑞波
5. 分析檢測中液相色譜柱的選擇及使用維護(hù)_劉藝
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