非臨床安全性研究很重要的一個目的是確定藥物的毒性靶器官、毒性表現(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)可用于計算首次人體試驗(yàn)的劑量，支持藥物臨床開發(fā)。NOAEL（No Observed Adverse Effect Level，未見明顯毒性反應(yīng)劑量）在健康成年志愿者首次臨床試驗(yàn)藥物最大推薦起始劑量估算過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用。除了NOAEL，MABEL（minimal anticipated biological effect level）、HNSTD（highest non-severely toxic dose）、STD10（severely toxic dose in 10% of the animals）也被用來作為某些藥物首次人體試驗(yàn)起始劑量的計算。無論何種計算路徑，對于非臨床研究中的異常發(fā)現(xiàn)是adverse、non-adverse的判定都是核心，而這一鑒別又頗具挑戰(zhàn)，有時偏主觀。本文結(jié)合FDA、Amgen、Gilead、Celldex Therapeutics等團(tuán)隊最新觀點(diǎn)，圍繞毒性反應(yīng)、NOAEL判定原則、挑戰(zhàn)、案例進(jìn)行分享。
首先看下對于adverse effect的定義，來自兩個版本。
European Society of Toxicologic Pathology: An adverse effect is a test item-related change in the morphology, physiology, growth, development, reproduction or life span of the animal model that likely results in an impairment of functional capacity to maintain homeostasis and/or an impairment of the capacity to respond to an additional challenge.
The Illustrated Dictionary of Toxicologic Pathology and Safety Science: adverse effects (in toxicology studies) are any changes related to treatment with a test substance that are considered as potentially harmful to the well-being of the test species, resulting in dysfunction, or negatively impacting the ability of an animal to thrive or develop normally.
兩個版本來源的定義描述不同，但底層邏輯類似，首先是需要發(fā)現(xiàn)一些changes，或許是與平行對照比，或者與歷史背景數(shù)據(jù)比，或者通過劑量依賴性關(guān)系判定。其次，需要對發(fā)現(xiàn)的changes進(jìn)行定性，是否影響了動物的某些功能、生長、發(fā)育等等。
關(guān)于NOAEL的確定，通常采用“三步法”，如下圖所示。
第一步：確定是否是供試品相關(guān)的作用
關(guān)于這點(diǎn)，可以從4個問題驅(qū)動，輔助判斷。
1、是否在歷史對照數(shù)據(jù)范圍內(nèi)和/或具有統(tǒng)計學(xué)意義？
對于定量數(shù)據(jù)，首先應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，看下高劑量與對照組、低劑量之間的統(tǒng)計學(xué)差異。尤其是嚙齒類動物，每組動物數(shù)量多，且遺傳同質(zhì)性好，更適用于均值比較和統(tǒng)計分析。對于非嚙齒類動物，由于每組動物數(shù)量少，個體動物發(fā)現(xiàn)有時比均值更有意義。建議從總體證據(jù)考量發(fā)現(xiàn)的毒性，而不是單一指標(biāo)的變化，比如肝臟生化指標(biāo)的變化是否伴隨大體解剖、組織病理學(xué)檢查的異常。
當(dāng)然，并不是所有毒理學(xué)終點(diǎn)都可進(jìn)行統(tǒng)計運(yùn)算，如組織病理學(xué)檢查中的發(fā)生率和嚴(yán)重程度通常不進(jìn)行統(tǒng)計分析。類似這種情況，需要結(jié)合平行設(shè)置的對照組表現(xiàn)和歷史對照數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)果判定。這里就比較考驗(yàn)每個機(jī)構(gòu)歷史對照數(shù)據(jù)的質(zhì)量了。
2、是否有劑量/暴露量-反應(yīng)關(guān)系？
雖然不絕對，但絕大多數(shù)毒性發(fā)現(xiàn)，如果無劑量或暴露量相關(guān)性，與供試品相關(guān)的可能性通常較低。從藥代動力學(xué)角度，藥物暴露量（AUC或Cmax）隨著給藥劑量升高而升高，但涉及吸收或消除飽和，劑量和暴露量的升高不一定成比例。一般毒理研究中會伴隨毒代動力學(xué)研究，可同時結(jié)合劑量/暴露量數(shù)據(jù)，分析與毒性發(fā)生率、嚴(yán)重程度的相關(guān)性。特別提示兩點(diǎn)，有些毒性反應(yīng)如功能組合試驗(yàn)（functional observational batteries）、心電圖、血壓對血藥濃度更敏感，建議結(jié)合Cmax分析。另外，有些毒性如果僅在高劑量出現(xiàn)，低、中劑量未見，且暴露量是線性增加的，也提示該毒性反應(yīng)為供試品相關(guān)。
3、給藥組的反應(yīng)是否比對照組觀察到的更嚴(yán)重？
非臨床研究用動物通常都會有背景病變，因這種病變的發(fā)生類型、發(fā)生率和嚴(yán)重程度不同，平行設(shè)置的對照組動物并不一定能客觀反映背景病變情況。舉個例子，一項6個月SD大鼠重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中，雌性動物觀察到頻率和嚴(yán)重程度均呈劑量相關(guān)性的腎上腺皮質(zhì)囊性變性，雄性動物呈現(xiàn)類似發(fā)生率的多灶性腎上腺皮質(zhì)空泡化，平行設(shè)置的對照組動物未見類似病變。腎上腺異常是大鼠年齡相關(guān)性自發(fā)性病變，且SD大鼠發(fā)生率更高。最后結(jié)論是供試品有可能會加重大鼠腎上腺背景病變，但考慮到這一病變是大鼠自發(fā)性年齡相關(guān)改變，不視為毒性反應(yīng)（not considered adverse）。當(dāng)然，這種結(jié)論的得出需要結(jié)合研究機(jī)構(gòu)的背景數(shù)據(jù)和大量文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行討論。
4、這一反應(yīng)是在整個研究過程中一直存在，還是一過性的或偶發(fā)的？
這個問題適用于研究過程中反復(fù)觀測的毒性終點(diǎn)，比如臨床觀察、體重、攝食量、臨床病理等。如果某些臨床癥狀僅在個別動物出現(xiàn)，并不是在整個研究中出現(xiàn)，僅是偶發(fā)的，通常不認(rèn)為是供試品暴露引起的。不過，這個問題也需要辨證看，不能將所有一過性、偶發(fā)性的毒性發(fā)現(xiàn)，均視為非給藥相關(guān)。尤其是臨床病理數(shù)據(jù)，比如ALT和AST一過性升高，意味著可能的肝細(xì)胞損傷，隨著給藥繼續(xù)，有可能肝細(xì)胞由變性進(jìn)展到壞死，出現(xiàn)代償性肝細(xì)胞增殖或纖維化，ALT和AST反而回到基線，不再升高。這種情況，可以結(jié)合病理或其它肝臟標(biāo)記物一起判斷，不可輕易排除。
第二步：確定供試品相關(guān)作用是否是毒性反應(yīng)
關(guān)于這點(diǎn)，可以從6個問題驅(qū)動，輔助判斷。
1、是否足夠嚴(yán)重到引起功能損傷？
通常體重、攝食量和臨床觀察可以幫助從整體判斷動物的健康狀況。如果這些參數(shù)的異常關(guān)聯(lián)到動物功能的損傷，則判定為毒性反應(yīng)。對于什么程度的變化認(rèn)定為異常，OECD發(fā)布過指導(dǎo)原則《Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Use in Safety Evaluation》。以體重為例，對于非減肥藥物，體重降低20%以上通常認(rèn)為是adverse。當(dāng)然，還是那句話，不要孤立的通過一個指標(biāo)輕易下結(jié)論，結(jié)合對照數(shù)據(jù)、統(tǒng)計學(xué)、量效關(guān)系變化、指標(biāo)變化的連續(xù)性等綜合分析。
通過臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)判定毒性反應(yīng)是有一定挑戰(zhàn)的。鈉、鉀、鈣、葡萄糖、血紅蛋白和血小板，視變化程度大小判定是否是毒性反應(yīng)。單純的ALT、AST、LDH變化通常不視為毒性反應(yīng)，可以作為組織損傷的biomarker，需要結(jié)合其它臨床病理參數(shù)及組織病理學(xué)數(shù)據(jù)共同確認(rèn)。像總蛋白、白蛋白這類體現(xiàn)肝功能的參數(shù)，低于一定數(shù)值可判定為毒性反應(yīng)。
組織病理學(xué)檢查結(jié)果根據(jù)病灶病變嚴(yán)重程度進(jìn)行分級，通常“minimal”不記為毒性反應(yīng)，“marked”或“severe”則視為毒性反應(yīng)。也有些特例，比如神經(jīng)元壞死的“minimal”分級則視為毒性反應(yīng)。
2、是否是適應(yīng)性反應(yīng)？
為應(yīng)對有毒物質(zhì)的侵犯，機(jī)體為維持穩(wěn)態(tài)或產(chǎn)生防御，通常會出現(xiàn)代償性變化，稱之為適應(yīng)性反應(yīng)。這種適應(yīng)性反應(yīng)通常是快速的、可逆的，不會對機(jī)體造成損傷。比如苯巴比妥、美沙酮、纖維蛋白或肝藥酶誘導(dǎo)劑，給藥后會出現(xiàn)肝臟重量增加、肝變大、鏡檢可見肝細(xì)胞肥大，伴隨多次給藥后的藥物暴露量下降。這類變化如果未引起其它degenerative changes，通常不視為毒性反應(yīng)。
3、反應(yīng)是否可逆？
并不是說部分或完全可逆的反應(yīng)就不視為毒性反應(yīng)，而是需要結(jié)合所有毒理學(xué)發(fā)現(xiàn)和證據(jù)權(quán)重分析進(jìn)行綜合研判?？赡嫘钥勺鳛檎w性的一部分，輔助判斷毒性發(fā)現(xiàn)的嚴(yán)重程度。
4、是供試品引發(fā)的原發(fā)作用還是繼發(fā)作用？
首先，無論是藥物引起的原發(fā)作用，還是由原發(fā)作用進(jìn)一步引發(fā)的繼發(fā)作用，都會用于評估是否是毒性反應(yīng)。不過，有些繼發(fā)作用可以通過人道關(guān)懷、獸醫(yī)護(hù)理等得以改善。比如藥物可引起犬惡心，出現(xiàn)流涎、嘔吐等癥狀，繼而導(dǎo)致攝食量降低、體重下降，通過延長食物供給時間，攝食和體重可恢復(fù)。這類情況，前期動物出現(xiàn)的攝食量和體重異常則不視為毒性反應(yīng)。
5、是否是藥理作用的放大？
藥理作用的放大就一定是non-adverse嗎？答案當(dāng)然是否定的。還是要視藥理作用放大的程度及所引發(fā)作用的嚴(yán)重程度而定。比如免疫激動劑可過度激活免疫系統(tǒng)，釋放細(xì)胞因子，并可能出現(xiàn)動物攝食量、體重下降的情況，甚至導(dǎo)致動物不能耐受，則可判定為adverse effect。藥理作用的分類太過寬泛，這也給藥理作用放大后的adverse、non-adverse的判定帶來很大挑戰(zhàn)，比如作用于CNS的藥物引發(fā)的動物平衡、協(xié)調(diào)失調(diào)，催眠類藥物可使動物喪失基本能力。有時很難對這類毒性反應(yīng)進(jìn)行區(qū)分和定性，需要結(jié)合嚴(yán)重程度、發(fā)生率、發(fā)生的頻率綜合判定。
6、基于證據(jù)權(quán)重判斷藥物反應(yīng)是否嚴(yán)重到影響器官或機(jī)體的功能
這點(diǎn)還是強(qiáng)調(diào)基于總體的證據(jù)對藥物所致的毒性發(fā)現(xiàn)進(jìn)行綜合分析。通?；诙纠碓囼?yàn)中所有可獲得數(shù)據(jù)、文獻(xiàn)資料，GLP機(jī)構(gòu)的SD會對出現(xiàn)的藥物反應(yīng)的定性有個大致判斷。當(dāng)然，對于疑問之處，也可與同行、顧問、專家進(jìn)行進(jìn)一步討論。藥企sponsor對藥物的整體縱深了解通常更為全面，有比較詳細(xì)的藥效學(xué)、藥代動力學(xué)和毒理學(xué)資料，通常也熟悉同類產(chǎn)品的臨床研究結(jié)果，故與sponsor的充分溝通也是非常關(guān)鍵的。
第三步：確定NOAEL
NOAEL的確定說簡單也簡單，比如中劑量觀測到供試品相關(guān)的毒性反應(yīng)，低劑量未觀測到，則低劑量可定為NOAEL。不過，在具體決策過程中還是有3個問題需要思考。
1、對于毒性反應(yīng)非劑量依賴的情況：暴露量是線性還是非線性？
線性PK的AUC和Cmax隨劑量增加而成比例增加，表觀分布容積、消除半衰期、清除率則劑量間表現(xiàn)一致。相反，非線性PK的AUC和Cmax與劑量的增加不成比例，表觀分布容積、消除半衰期、清除率在不同劑量間也有差異。有時會出現(xiàn)中劑量血藥濃度更高，出現(xiàn)毒性反應(yīng)，高劑量反而血藥濃度降低，未見毒性反應(yīng)的情況，這種情況下的NOAEL應(yīng)定為低劑量。
2、毒性反應(yīng)是否有性別差異？
不同性別之間的藥物PK和毒性敏感度不同還是挺常見的。如果有明確證據(jù)說明這點(diǎn)，就需要雌雄動物分別界定NOAEL劑量，取劑量更低者用于臨床起始劑量的計算。當(dāng)然，不出意外的話的還是有意外出現(xiàn)，比如一個藥物臨床僅用于男性，但毒理試驗(yàn)采用的雙性別動物，雌性動物低劑量是NOAEL，雄性動物則是高劑量為NOAEL，這種情況自然可以選擇雄性動物的劑量進(jìn)行臨床起始劑量的計算。
3、是否有必要建立局部和系統(tǒng)NOAEL？
比如藥物低劑量可見注射位點(diǎn)反應(yīng)，但無其它毒性發(fā)現(xiàn)。中劑量既有注射位點(diǎn)反應(yīng)，也可見系統(tǒng)的毒性反應(yīng)。這類情況的處理方案通常有兩種，一種是低劑量定為系統(tǒng)NOAEL，但標(biāo)注有注射位點(diǎn)反應(yīng)。一種是繼續(xù)探索更低劑量，無注射位點(diǎn)反應(yīng)的局部NOAEL。關(guān)于注射位點(diǎn)反應(yīng)，如果不是比較嚴(yán)重的情況，通常不作為限制性因素影響NOAEL的制定。一是比較容易耐受，二是臨床可以給予抗組胺藥或其它藥物干預(yù)。
那有沒有需要界定特定器官NOAEL的情況呢。比如藥物IND后，監(jiān)管機(jī)構(gòu)對藥物的心臟安全性風(fēng)險有擔(dān)憂，要求提供進(jìn)一步數(shù)據(jù)說明。后續(xù)開展的毒理研究更多聚焦心臟重量、心臟毒性的biomarkers、心臟大體解剖、心臟的組織病理學(xué)檢查，未額外開展系統(tǒng)的毒理學(xué)研究，那最終獲得的NOAEL則是心臟特異性的。不過，這種情況并不多見。
案例分享
案例一
已上市非抗腫瘤藥物增加新給藥途徑，開展28天大鼠靜脈重復(fù)給藥毒理研究。高劑量出現(xiàn)震顫、步態(tài)改變、呼吸困難等嚴(yán)重臨床癥狀，鏡檢可見肝臟空泡化、垂體前葉變性。另外，可見劑量相關(guān)性的甲狀腺肥大。進(jìn)行了TK分析，但未開展甲狀腺激素檢測。
CRO SD：考慮到中劑量出現(xiàn)較minimal更為嚴(yán)重的甲狀腺肥大，NOAEL定為低劑量。
Sponsor：不認(rèn)可SD結(jié)論。提供了同一藥物其它種屬、更高劑量下、相同甲狀腺病理結(jié)果的數(shù)據(jù)，顯示未見體現(xiàn)甲狀腺功能的甲狀腺激素的異常。
CRO 病理學(xué)家：依然不為所動，堅持己見，認(rèn)為只有大鼠的功能性數(shù)據(jù)才能說明問題，其它種屬的不予考慮。
CRO高級毒理學(xué)家：查閱了該藥物前期上市時開展的大鼠13周重復(fù)經(jīng)口給藥毒理研究數(shù)據(jù)，更高暴露量情況下，未見甲狀腺激素的變化。
最終，CRO病理學(xué)家同意修改意見，判定中劑量出現(xiàn)的甲狀腺病理改變?yōu)閚on-adverse，SD修改NOAEL劑量為中劑量。這個案例首先判定甲狀腺肥大嚴(yán)重程度是劑量相關(guān)的，是與供試品有關(guān)的反應(yīng)。至于判定為毒性反應(yīng)還是非毒性反應(yīng)，不同相關(guān)方的結(jié)論不一。本文第二步的第1個問題，是否足夠嚴(yán)重到引起功能損傷，比較慶幸的是甲狀腺異常是有功能性biomarkers可以支持決策的。也提醒NOAEL的確定不僅需要采納本試驗(yàn)數(shù)據(jù)，還需結(jié)合前期數(shù)據(jù)、sponsor觀點(diǎn)等綜合考量。
案例二
ADC抗腫瘤產(chǎn)品，大鼠靜脈給藥3周毒理研究。骨髓、胸腺、脾臟、肺及睪丸均發(fā)現(xiàn)病理學(xué)變化，且呈劑量依賴性，低劑量嚴(yán)重程度是minimal/mild級別。除睪丸外，中、高劑量組動物的毒性發(fā)現(xiàn)經(jīng)6周恢復(fù)期后可逆性恢復(fù)。
基于以上信息，CRO SD將NOAEL定為了低劑量。Sponsor認(rèn)為低劑量用于計算起始劑量太低，咨詢了其它毒理顧問意見?？吹竭@，不曉得各位是否意識到其中的問題，供試品的臨床擬用適應(yīng)癥是腫瘤，根據(jù)ICH S9要求，嚙齒類動物STD10的1/10作為起始劑量，故應(yīng)該根據(jù)是否引發(fā)動物死亡/瀕死、威脅生命或不可逆毒性情況獲取STD10，而不單純是NOAEL。當(dāng)然，最后SD對報告進(jìn)行了調(diào)整。這個案例提示我們，不是所有試驗(yàn)都需要界定NOAEL。另外，CRO與Sponsor的充分溝通非常關(guān)鍵，不要等到最后試驗(yàn)都做完了，產(chǎn)品目標(biāo)適應(yīng)癥還不清楚。
案例三
一個多肽類藥物，擬用于非腫瘤適應(yīng)癥，皮下給藥，犬9個月重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)。給藥2個月時，中、高劑量組注射部位出現(xiàn)中重度紅斑和水腫，而且注射位點(diǎn)反應(yīng)已經(jīng)影響到繼續(xù)給藥。鑒于這種情況，CRO和sponsor進(jìn)行了密切溝通和反復(fù)討論，提出了各種各樣的解決方案，包括重新開展研究、增設(shè)更低劑量組動物，兩個路徑都涉及費(fèi)用和時間的大量增加，而且在已經(jīng)進(jìn)行的試驗(yàn)期間增設(shè)組別非常麻煩。還有一種方案是因低劑量未見注射部位反應(yīng)，說明該毒性表現(xiàn)是劑量相關(guān)的，可以嘗試降低中、高劑量組的劑量解決。亦或者對于感染動物先停藥，恢復(fù)后繼續(xù)用藥。還可以改變注射部位，換其它位點(diǎn)。另外，研究發(fā)現(xiàn)注射位點(diǎn)反應(yīng)是組胺介導(dǎo)的，可以給予抗組胺藥物處理，增加局部耐受。最后，經(jīng)過多方討論，采用的是給予抗組胺藥+動物短暫給藥休息+調(diào)整注射位點(diǎn)方案，順利完成了9個月的給藥周期。
最后給出了兩個NOAEL，低劑量為局部NOAEL，高劑量為系統(tǒng)NOAEL。這個案例提示我們，試驗(yàn)出現(xiàn)問題不可怕，充分的頭腦風(fēng)暴、信息互通對于解決問題反而頗為重要。對于注射位點(diǎn)反應(yīng)這點(diǎn)，正文中已有解釋，不再贅述。
案例四
一個小分子藥物，擬用于非腫瘤適應(yīng)癥，經(jīng)口給藥，大鼠6個月重復(fù)給藥毒理試驗(yàn)。高劑量組在給藥第30天，中劑量組動物在給藥第100天，低劑量組在第130天出現(xiàn)seizures癥狀。有時發(fā)生在藥后幾秒，有時發(fā)生在采血、體重測量、換籠等日常操作過程中，持續(xù)約1分鐘。每個組別seizures發(fā)生率和發(fā)生次數(shù)如下表所示。
動物體重、攝食量等其它指標(biāo)均正常。也未見動物發(fā)作后抑郁表現(xiàn)?；謴?fù)期也未見動物出現(xiàn)seizures。雖然未見動物死亡/瀕死，考慮到高劑量組動物發(fā)作的頻率較高，sponsor決定在第90天時，高劑量組動物停止給藥，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，其它動物按原定方案繼續(xù)用藥。病理發(fā)現(xiàn)高劑量組腦部空泡化。結(jié)合病理結(jié)果和臨床癥狀觀察，高劑量組出現(xiàn)的seizures定性為毒性反應(yīng)。很明顯seizures發(fā)生率呈劑量相關(guān)性，是供試品相關(guān)的。但問題也來了，所有的seizures都應(yīng)視為毒性反應(yīng)嗎？單次seizures發(fā)作算毒性反應(yīng)嗎？低劑量組的seizures發(fā)生率算毒性反應(yīng)還是非毒性呢？關(guān)于這點(diǎn)，CRO公司、申報方和其它相關(guān)團(tuán)隊并未完全達(dá)成一致。
最后，將低劑量定為NOAEL，該組的seizures定性為可能的非毒性反應(yīng)（likely non-adverse）。原因如下：1）低劑量組發(fā)生率很低，與對照組幾乎相當(dāng)；2）動物并未在Tmax時間點(diǎn)發(fā)作，更多在被操作時發(fā)作，不具備血藥濃度依賴；3）發(fā)作時間歇性的，數(shù)天到數(shù)周不等；4）動物未見發(fā)作后抑郁，而是發(fā)作后快速恢復(fù)，并正常生活；5）整個治療期間動物健康存活；6）動物未見其它指標(biāo)異常。
暫不提這些原因有些是不是稍顯牽強(qiáng)，這個案例對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性反應(yīng)相關(guān)的NOAEL界定，還是有參考價值的。
案例五
一個小分子藥物，擬用于非腫瘤適應(yīng)癥，經(jīng)口給藥，大鼠3個月重復(fù)給藥毒理試驗(yàn)。中、高劑量組動物出現(xiàn)腎毒性、臨床癥狀異常（藥后1h內(nèi)約50%動物出現(xiàn)沒有精神）、體重降低（平均20%）。此外，高劑量組出現(xiàn)動物死亡。所有劑量組動物均出現(xiàn)肝細(xì)胞脂質(zhì)增加、肝臟重量增加、肝小葉中心肥大，嚴(yán)重程度呈劑量依賴性增加。提交到監(jiān)管機(jī)構(gòu)的資料顯示，中劑量被定為NOAEL，脂質(zhì)代謝異常、臨床癥狀異常和體重降低未被視為毒性反應(yīng)。當(dāng)然，監(jiān)管機(jī)構(gòu)最終不同意這一NOAEL選擇，認(rèn)為應(yīng)該將低劑量作為NOAEL。監(jiān)管機(jī)構(gòu)認(rèn)為中、高劑量組轉(zhuǎn)氨酶升高、肝細(xì)胞脂質(zhì)增加、血漿膽固醇增加等多個臨床病理指標(biāo)異常均指向了脂質(zhì)代謝過程的異常，應(yīng)視為毒性反應(yīng)。再結(jié)合腎毒性、體重降低、臨床觀察異常，中劑量不應(yīng)作為NOAEL。
篇幅所限，更多案例有時間另起一篇再單獨(dú)介紹吧。本文更多是把a(bǔ)dverse和non-adverse判定的基本邏輯、大致過程和核心問題做下梳理，可以看到，NOAEL的確定是一項復(fù)雜、系統(tǒng)的技術(shù)活，需要有一套嚴(yán)格的決策步驟，不是完全憑主觀和經(jīng)驗(yàn)武斷給出答案。更何況，NOAEL的確定涉及到臨床起始劑量的選擇，定的過低，需要額外爬坡，費(fèi)時費(fèi)力費(fèi)錢。定的過高，如果不合理，監(jiān)管機(jī)構(gòu)不會同意，也會增加注冊時長。
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